Identificación molecular del hongo Colletotrichum spp., aislado de banano (Musa spp) de la altura en la zona de Turrialba y determinación de su sensibilidad a fungicidas poscosechaResúmenes
La antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum spp., es una de las principales enfermedades poscosecha que afectan el fruto del banano. En el presente experimento, 25 aislamientos de Colletotrichum spp., obtenidos de frutos de banano provenientes de 5 zonas del cantón de Turrialba, Costa Rica, fueron utilizados para caracterizar molecularmente al hongo y evaluar su sensibilidad in vitro a 3 fungicidas poscosecha: tiabendazol, imazalil y miclobutanil. La identificación molecular de cada uno de los aislamientos se realizó mediante la técnica PCR con los imprimadores especie-específicos de la región ITS (CgInt/ITS5) y de una región del gen de la ß-tubulina (TBCG/ TB5). Para las pruebas de sensibilidad in vitro a los 3 fungicidas, se utilizaron las siguientes concentraciones: 0,1; 1,0; 10,0 y 100,0 µg.ml<span name="style_sup">-1</span>. El análisis de la región ITS y de la región del gen de la β-tubulina, indicó que los aislamientos analizados corresponden a la especie <span name="style_italic">Colletotrichum</span> gloeosporioides. En cuanto a las pruebas de sensibilidad in vitro, todos los aislamientos fueron sensibles al tiabendazol, mientras que existe una marcada insensibilidad al imazalil y al miclobutanil. gloeosporioides. En cuanto a las pruebas de sensibilidad in vitro, todos los aislamientos fueron sensibles al tiabendazol, mientras que existe una marcada insensibilidad al imazalil y al miclobutanil.
Antracnosis; PCR; poscosecha; tiabendazole; imazalil; miclobutanil
Anthracnose is one of the most serious banana post-harvest diseases. A total of 25 <span name="style_italic">Colletotrichum</span> isolates were obtained from banana fruits grown in 5 areas in Turrialba County, Costa Rica; 5 isolates per area. Isolates were characterized on the basis of polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers of the ITS region and ß-tubulin, gene, and their in vitro sensitivities to the fungicides thiabendazole, imazalil and myclobutanil at 0.1, 1.0, 10.0 y 100.0 µg.ml<span name="style_sup">-1</span>. All isolates were identified as <span name="style_italic">Colletotrichum</span> gloeosporioides and were sensitive to thiabendazole, whereas most isolates showed a marked reduction in sensitivity to imazalil and myclobutanil. gloeosporioides and were sensitive to thiabendazole, whereas most isolates showed a marked reduction in sensitivity to imazalil and myclobutanil.
Anthracnose; PCR; postharvest; thiabendazole; imazalil; miclobutanil
Identificación molecular del hongo Colletotrichum spp., aislado de banano (Musa spp) de altura en la zona de Turrialba y determinación de su sensibilidad a fungicidas poscosecha
Eduardo Salazar1/*+, Ramses Hernández**+, Ana Tapia***+, Luis Gómez-Alpízar****+
*Dirección para correspondencia:
Resumen
La antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum spp., es una de las principales enfermedades poscosecha que afectan el fruto del banano. En el presente experimento, 25 aislamientos de Colletotrichum spp., obtenidos de frutos de banano provenientes de 5 zonas del cantón de Turrialba, Costa Rica, fueron utilizados para caracterizar molecularmente al hongo y evaluar su sensibilidad in vitro a 3 fungicidas poscosecha: tiabendazol, imazalil y miclobutanil. La identificación molecular de cada uno de los aislamientos se realizó mediante la técnica PCR con los imprimadores especie-específicos de la región ITS (CgInt/ITS5) y de una región del gen de la ß-tubulina (TBCG/ TB5). Para las pruebas de sensibilidad in vitro a los 3 fungicidas, se utilizaron las siguientes concentraciones: 0,1; 1,0; 10,0 y 100,0 µg.ml-1. El análisis de la región ITS y de la región del gen de la β-tubulina, indicó que los aislamientos analizados corresponden a la especie Colletotrichum gloeosporioides. En cuanto a las pruebas de sensibilidad in vitro, todos los aislamientos fueron sensibles al tiabendazol, mientras que existe una marcada insensibilidad al imazalil y al miclobutanil.
Palabras clave: Antracnosis, PCR, poscosecha, tiabendazole, imazalil, miclobutanil
Abstract
Molecular identification of the fungus Colletotrichum spp., isolated from banana (Musa spp) in high lands from Turrialba and determination of their sensitivity to postharvest fungicides. Anthracnose is one of the most serious banana post-harvest diseases. A total of 25 Colletotrichum isolates were obtained from banana fruits grown in 5 areas in Turrialba County, Costa Rica; 5 isolates per area. Isolates were characterized on the basis of polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers of the ITS region and ß-tubulin, gene, and their in vitro sensitivities to the fungicides thiabendazole, imazalil and myclobutanil at 0.1, 1.0, 10.0 y 100.0 µg.ml-1. All isolates were identified as Colletotrichum gloeosporioides and were sensitive to thiabendazole, whereas most isolates showed a marked reduction in sensitivity to imazalil and myclobutanil.
Keywords: Anthracnose, PCR, postharvest, thiabendazole, imazalil, miclobutanil.
Introducción
El cultivo del banano (Musa spp) es una fuente importante de trabajo e ingresos en los países donde se produce. En Costa Rica, el banano se cultiva en forma comercial en zonas de alta precipitación y temperatura promedio de 30°C, ubicadas hasta los 300 msnm. Actualmente existe interés en la producción de banano en áreas localizadas a mayores altitudes, entre 440 y 1300 msnm (banano de altura), ya que la fruta tiene un sabor más dulce (A. Tapia 2009. Comunicación personal, Ramírez 2010); esto debido a que su ciclo de producción es más prolongado y se da una mayor acumulación de almidones que posteriormente son desdoblados en azúcares durante la maduración. Adicionalmente puede haber una mayor acumulación de fructosa que es 5 veces más dulce que la glucosa. La fruta proveniente de estas áreas podría comercializarse en los mercados como un producto diferenciado, eventualmente a un mayor precio. Junto con la mejora en el sabor de la fruta, también se busca que sea producida bajo un esquema de reducción o no uso de fungicidas, dada la preferencia creciente de los consumidores por productos obtenidos sin el uso de agroquímicos. Sin embargo, la fruta producida bajo este esquema de no uso de agroquímicos, puede presentar mayores daños por patógenos en poscosecha, favorecidos por la edad de cosecha y por el tiempo transcurrido desde su cosecha hasta alcanzar el mercado final de destino (Alvindia y Natsuaki 2008). En Costa Rica, la información disponible para banano de altura sobre los daños poscosecha y los patógenos asociados es limitada.
La antracnosis es una de las principales enfermedades poscosecha del banano e influye significativamente en la calidad de la fruta mercadeable. Los síntomas se presentan como lesiones ovaladas, oscuras y hundidas, con presencia de acérvulos (masas de esporas). La infección del fruto ocurre normalmente en campo durante su desarrollo; pero permanece latente hasta que el fruto madura (Raut y Ranade 2004), por lo que los síntomas se manifiestan mayormente durante el almacenamiento y muchas veces en los supermercados. La antracnosis es más severa si el fruto sufre heridas o lesiones como resultado de un mal manejo de la fruta.
Colletotrichum musae(Berk and Curtis) Arx ha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano con base en descripciones morfológicas y el alto grado de especificidad por el hospedante. Sin embargo, existe evidencia que aislamientos deColletotrichumprovenientes de un mismo hospedante pueden pertenecer a diferentes especies, por lo que el criterio de especificidad por hospedante para la identificación del agente causal de la enfermedad es inapropiado y genera confusión (Peres et al. 2002, Lima et al. 2003, Hernández 2009, Jeger et al. 1995, Pholivong et al. 2010). Una variabilidad morfológica y patogénica entre aislamientos deC. musaeha sido observada y se ha demostrado la existencia de razas fisiológicas o biotipos (Moriwaki et al. 2002, Peres et al. 2002, Ureña et al. 2002, Guerber et al. 2003, Liu et al. 2007). Análisis filogenéticos recientes indican queC. musaey C. gloeosporoides son conspecíficas; es decir una misma especie (Du et al. 2005, Hernández 2009). Phoulivong et al. (2010) determinaron que aunque C. gloeosporoides yC. acutatumhan sido consideradas las especies responsables de la antracnosis en frutos tropicales, ninguna de estas especies fue identificada como el agente causal de la enfermedad en Laos y Tailandia. Su estudio incluyó 25 aislamientos provenientes de guayaba, mango, papaya, y banano, entre otros.
Actualmente, el combate de la antracnosis en banano se basa en la aplicación de fungicidas poscosecha; específicamente el tiabendazol e imazalil (Villalta et al. 2006, Guzmán y Villalta 2008), así como la implementación de prácticas culturales en campo y en la planta empacadora para la reducción del inóculo. Otros 2 fungicidas registrados para uso poscosecha en banano son el miclobutanil y la azoxistrobina (Villalta et al. 2006, Guzmán y Villalta 2008).
Estos fungicidas son considerados de sitio específico, e inhiben un proceso particular del metabolismo del patógeno. El uso de fungicidas de este tipo enfrenta el problema de la selección de individuos resistentes en la población del patógeno blanco (Hernández 2009), que resulta en una disminución en la eficacia de los productos y una pérdida de esta estrategia de combate.
El cantón de Turrialba, provincia de Cartago, posee las condiciones agroclimáticas, así como disponibilidad de mano de obra, vías de comunicación, cercanía a un puerto, entre otras, que le confieren el potencial para la producción de banano de altura. En la zona existen algunas plantaciones de banano con las variedades Gros Mitchel y Congo.
El objetivo de esta investigación fue determinar la(s) especie(s) deColletotrichumasociada(s) con la antracnosis en frutos de banano (Musaspp) de altura en el cantón de Turrialba y su sensibilidad a los fungicidas tiabendazol, imazalil y miclobutanil.
Materiales y Métodos
Material vegetal
En la presente investigación se recolectaron racimos de banano de las variedades Gros Michel y Congo en 5 zonas del cantón de Turrialba, Cartago, ubicadas entre los 440 y los 1160 msnm; por lo que se considera banano de altura (Cuadro 1).
Los racimos recolectados tenían un calibre entre 38 y 40 32avos de pulgada en el dedo central de la segunda mano de arriba hacia abajo. Una vez seleccionados, los racimos se “desmanaron” y empacaron en bolsas plásticas con papel húmedo en su interior y luego se colocaron en cajas plásticas para su transporte. Cada caja se identificó con la zona de procedencia y la fecha de muestreo. Las cajas plásticas se colocaron en una cámara de almacenamiento con una tempera- tura de 25°C y una humedad relativa del 95% con la finalidad de promover la maduración natural de los frutos y la aparición de los síntomas de la enfermedad. Las cajas se revisaron cada 2 días para verificar la presencia de signos (acérvulos) del patógeno. Los aislamientos se realizaron en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad de Costa Rica Sede del Atlántico (Turrialba). Se escogieron 5 aislamientos para cada una de las 5 zonas del cantón de Turrialba, provincia de Cartago (Figura.1).
Obtención de aislamientos monospóricos
Con ayuda de una aguja de disección estéril se rasparon las lesiones sobre la cáscara de los frutos de banano que presentaban una cantidad visible de acérvulos y se colocó el raspado en un erlenmeyer con 25 ml de agua destilada estéril. Posteriormente, se tomó una alícuota de 10 µl y se colocó en una caja Petri con medio de cultivo Agar-Agua (BactoiMAgar. Difco, Le Pont de Claix, Francia) enmendado con 0,5 g.l-1 de cloranfenicol para evitar el crecimiento de bacterias.
La suspensión de esporas se distribuyó sobre la superficie de la caja Petri con ayuda de un asa, con el fin de que las esporas quedaran suficientemente separadas. Posteriormente, las cajas Petri se colocaron en una incubadora por 14 h aproximadamente, a una temperatura de 24ºC. Transcurrido este tiempo y con ayuda de un estereoscopio se identificaron las esporas ligeramente germinadas y se procedió a transferir las esporas individuales a nuevas cajas Petri con el medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar, PDA. Difco, Le Pont de Claix, Francia) enmendado con cloranfenicol 0,5 g.l-1 para evitar el crecimiento bacterial. Una espora por caja Petri. Las cajas Petri se colocaron en una incubadora con una temperatura entre 24 y 26ºC por 8 días.
Identificación molecular
Extracción de ADN del hongo
La extracción de ADN se hizo a partir del micelio de cada uno de los 25 cultivos monospóricos (monoconidiales) obtenidos. La extracción del ADN se realizó mediante el protocolo descrito por Rogers y Bendich (1988) con algunas modificaciones.
Identificación de especies mediante imprimadores específicos
Para la identificación de las especies deColletotrichumasociadas a la antracnosis de banano de altura se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para la amplificación con imprimadores o iniciadores específicos de 2 regiones genómicas: 1. la región de los espaciadores internos transcritos, ITS (Internal Transcribed Spacers, ITS1-5.8S-ITS2, por sus siglas en inglés), del ADN ribosomal (ADNr) y 2. una porción del gen de la β-Tubulina 2.
Para la amplificación de la región ITS se usaron los imprimadores CgInt (5’GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG3’) paraC. gloeosporioidesy CaInt2 (5’GGGGAAGCCTCTCGCGG3’), paraC. acutatum, combinados con el imprimador universal ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’). Las combinaciones de imprimadores fueron CgInt e ITS4 y CaInt2 e ITS4 (Sreenivasaprasad et al. 1996), respectivamente. La porción del gen de la β-Tubulina 2 se amplificó con los imprimadores específicos TBCG (C. gloeosporioides, 5’ CGGAAGCCTGGGTAGGAGCG 3’) y TBCA (C. acutatum, 5’ CGGAGGCCTGGTT- GGGTGAG 3’), combinados con el imprimador TB5 (5’GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTT3’) (Valero et al. 2010). Cada par de imprimadores se empleó de manera independiente.
Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 µl, la mezcla consistió en: 2,5 µl de Dreamtaq buffer 10X, 1,6 µM de cada imprimador, 1,7 mM de MgCl2, 0,16 mM de dNTPs, 0,4 mg.ml-1 BSA, 1,5 UTaqPolimerasa (Fermentas), aproximadamente 30 ng de ADN molde y agua nanopura estéril. La amplificación se realizó en un termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler con el siguiente programa térmico (ITS/ β-Tubulina): desnaturalización inicial a 94ºC por 3/5 min; 25/30 ciclos de desnaturalización a 94ºC, por 30/45 s, alineamiento a 57ºC/62ºC por 60/30 s; extensión inicial a 72ºC por 45/120 s; y una extensión final de 72ºC por 5/7 min. En todos los casos se incluyó controles positivos paraC. gloeosporioides y C. acutatum, así como un control negativo (sin ADN). El producto de PCR se analizó por electroforesis en geles de agarosa al 1% en 0,5X TBE buffer (Tris 10mM, Borato 20 mM, EDTA 1mM) con GelRed (2 µl/50ml). Las condiciones de la electroforesis fueron 80 voltios por 90 min. Para visualizar el producto de PCR, luego de la electroforesis los geles se colocaron en un transiluminador Kodak EDAS 290.
Evaluación de la sensibilidad in vitro a 3 fungicidas
Para cada fungicida, Mertec 50 SC (ia. tiabendazol), Magnate 75 SG (ia. imazalil) y Rally 40 WP (ia. miclobutanil), se preparó una solución madre a 2000 µg.ml-1 , a partir de la cual se obtuvo las concentraciones a evaluar. El medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA. Difco, Le Pont de Claix, Francia) fue enmendado con una alícuota de la solución madre de manera que se obtuviera las siguientes concentraciones: 0,0; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0 µg.ml-1 .
De cada aislamiento (25 en total) se toma- ron discos de 8 mm de diámetro del borde de una colonia de 7 días de establecida en medio PDA, como se describió anteriormente. Los discos se colocaron en el centro de las placas Petri en forma invertida, de manera que el micelio quedara en contacto directo con el medio PDA enmendado con cada uno de los fungicidas. Para cada aislamiento y concentración de fungicida se prepararon 4 placas Petri. Las placas Petri se incubaron a una temperatura entre 22ºC y 24ºC durante 8 días, posteriormente se midió el diámetro de la colonia del hongo en forma horizontal y vertical (diámetro más largo y más corto), y se calculó el promedio para cada aislamiento en cada tratamiento.
Análisis de los datos
Evaluación in vitro de la sensibilidad del crecimiento micelial del hongoColletotrichumsp., a 3 fungicidas poscosecha.
La sensibilidad de cada aislamiento a los fungicidas se evaluó con base en la CE50(Concentración Efectiva Media), la concentración del fungicida que reduce el diámetro de la colonia en un 50% en el medio de cultivo enmendado con fungicida en relación con el crecimiento en el medio de cultivo sin fungicida. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fue determinado mediante la fórmula propuesta por Cole et al. (2005):
Para obtener los valores deCE50correspondiente a la concentración de cada fungicida, los valores promedio de inhibición de crecimiento micelial se graficaron contra el logaritmo de las concentraciones del fungicida y se determinó la regresión lineal. El logaritmo de laCE50se calculó basadao en la intercepción con el eje ´´x´´ que corresponde al valor del 50% de inhibición en la regresión lineal. Los valores de laCE50se calcularon como el antilogaritmo del resultado obtenido del logaritmo. Es decir, se reemplazó el valor “50” en las ecuaciones resultantes que relacionan la variable respuesta, el porcentaje de inhibición (y), con el logaritmo de la concentración del fungicida y se calculó el antilogaritmo.
Se empleó un diseño irrestricto al azar con un arreglo factorial 5x3x5 correspondiente a 5 zonas muestreadas, 3 fungicidas (Mertec 50 SC, Magnate 75 SG, Rally 40 WP) y 5 concentraciones de cada uno de los fungicidas (0,0; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0 ppm), con 4 repeticiones. Cada unidad experimental consistió de una caja Petri. Se comparó el valor medio de laCE50entre fungicidas para los 25 aislamientos y entre zonas muestreadas para cada fungicida con el programa Infostat Software Estadístico Versión 2008.
Resultados
Caracterización molecular
La amplificación del ADN, mediante PCR, con los imprimadores especie-específicos paraC. gloeosporioides(CgInt) en combinación con el imprimador universal ITS4, produjo un producto de PCR de aproximadamente 450 pb para los 25 aislamientos recolectados en las 5 zonas productoras de banano de altura del cantón de Turrialba; así como para el aislamiento control deC. gloeosporioides(+Cg), proveniente de frutos de papaya. Un ejemplo de los productos de PCR obtenidos se muestra en laFigura 2. No se obtuvo producto de amplificación con el aislamiento control deC. acutatum(+Ca). Un producto de PCR de aproximadamente 500 pb se obtuvo para el aislamiento controlC. acutatum(+Ca), cuando se empleó el par de imprimadores CaInt2 (específico paraC. acutatum) e ITS4; mientras que no hubo producto de amplificación para los aislamientos provenientes de banano de altura (Figura.3), ni para el control deC. gloeosporioides. En ambos casos, el tamaño de los productos de PCR corresponden al esperado con los imprimadores especie- específicos, 450 pbC. gloeosporioides y 500 pb C. acutatum, respectivamente (Sreenivasaprasad et al. 1996).
La amplificación del ADN de los 25 aislamientos provenientes de banano de altura con los imprimadores especie-específicos TBCG (C. gloeosporioides) yTBCA (C. acutatum), en combinación con el imprimador TB5, correspondientes a una región del gen de la β-tubulina, coincidió con los resultados anteriores. Un pro- ducto de PCR de aproximadamente 350 pb se observó para todos los aislamientos provenientes de banano y para el aislamiento control deC. gloeosporioides(+Cg), cuando se empleó el par de imprimadores TBCG y TB5; en tanto que no se obtuvo amplificación para el aislamiento con- trol deC. acutatum(+Ca). LaFigura 4muestra un ejemplo de los productos de PCR obtenidos con los imprimadores TBCG y TB5. Para el aislamiento control deC. acutatum(+Ca), un producto de PCR de aproximadamente 350 pb se produjo con la combinación de imprimadores TBCA y TB5, en tanto que para ninguno de los aislamientos de banano de altura o el control deC. gloeosporioides(+Cg) se observó producto de PCR (Figura 5). En ambos casos, el tamaño de los productos de PCR corresponden al esperado con estos imprimadores especie-específicos, 350 pbC. gloeosporioides y 350 pb C. acutatum (Valero et al. 2010).
Sensibilidad del crecimiento micelial del hongoColletotrichumsp., a los fungicidas tiabendazol, imazalil y miclobutanil
La CE50promedio para los 25 aislamientos varió significativamente (p<= 0,01) entre los 3 fungicidas evaluados (Cuadro 2). El fungicida tiabendazol presentó laCE50en sensibilidad lo presentó el tiabendazol con 16,12 veces de diferencia entre laCE50más alta y la más baja (FR). Imazalil y miclobutanil presentaron un FR similar 4,69 y 5,88 veces, respectivamente.
La frecuencia de aislamientos según suCE50se presenta en la Figura 6. Para los fun- gicidas tiabendazol e imazalil, los valores de promedio más baja 0, 072 µg.ml-1 , un rango deCE50presentaron una distribución unimodal; 0,008 a 0,129 µg.ml-1 , seguido por el imazalil (1,70 µg.ml-1 dentro de un rango de 0,06 a 5,10 µg.ml-1 ) y el miclobutanil (3,98 µg.ml-1 , en un rango de 1,07 a 6,30 µg.ml-1 ). El mayor rango mientras que para el miclobutanil se observó una distribución bimodal. Para el tiabendazol, todos los aislamientos presentaron valores promedio deCE50menores a 0,55 µg.ml-1 mientras que para el imazalil el 80% de los aislamientos mostró valores entre 1,0 y 3,0 µg.ml-1 y para el miclobutanil el 80% entre 3,0 y 7,0 µg.ml-1 .
En relación con las 5 zonas muestreadas, se observaron diferencias significativas (p≤0,01) para laCE50promedio entre zonas para cada fungicida y entre fungicidas para cada zona (Cuadro 3). Piedras Redondas presentó los valores más bajos deCE50para los fungicidas tiabendazol e imazalil (0,04 y 1,13 mg.l-1 respectivamente); mientras que para las otras zonas, el valor de laCE50dependió del fungicida. Algunas zonas, San Juan Sur por ejemplo, presentó el valor más alto deCE50para un fungicida (imazalil; 2,28 mg.l-1 ) y el más bajo para otro (miclobutanil; 1,10 mg.l-1 ).
Discusión
Al igual que los bananos producidos comercialmente en las zonas costeras, el banano producido en el cantón de Turrialba (banano de altura) y cultivados bajo un sistema de no aplicación de fungicidas también es afectado por la antracnosis, lo que podría limitar su comercialización como producto fresco de exportación. En Filipinas, pequeños productores cultivan banano cerca de sus casas sin la aplicación de fungicidas en pre o poscosecha, los cuales son exportados a Japón, donde los consumidores prefieren este tipo de producto, sin embargo, la calidad de los frutos al llegar al mercado final es muy pobre debido a las enfermedades poscosecha, entre ellas la antracnosis, con una incidencia del 83% (Alvindia y Natsuaki 2008).
Identificación molecular
La amplificación del ADN, mediante PCR con imprimadores específicos paraC. gloeosporioides y C. acutatum, tanto de la región ITS como para una porción del gen de la β-tubulina, indicó que los 25 aislamientos deColletotrichumspp., obtenidos de banano de altura en el cantón de Turrialba, corresponden a la especieC. gloeosporioides. Para ambas regiones se obtuvo un producto de PCR con los imprimadores específicos paraC. gloeosporioidespara los aislamientos provenientes de banano y el aislamiento control de (C. gloeosporioides) proveniente de papaya; pero no cuando se utilizó imprimadores específicos paraC. acutatum. Con estos últimos se obtuvo amplificación únicamente para el aislamiento control deC. acutatum. El tamaño de producto de PCR fue de 450 pb para CgInt /ITS4 y 350 pb para TBCG /TB5, correspondiente al tamaño esperado para la amplificación con estos imprimadores de ADN perteneciente aC. gloeosporioides(Sreenivasaprasad et al. 1996, Valero et al. 2010). Ambos pares de imprimadores se han utilizado ampliamente para la confirmación deC. gloeosporioidescomo el agente causal de la antracnosis en diferentes hospedantes, incluidos frutos tropicales como, mango, marañón y papaya (Sreenivasaprasad y Talhinhas 2005, Medeiros et al. 2010).
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Hernández (2009), para aislamientos costarricenses provenientes de fincas de banano para exportación, ubicadas en las zonas Huetar Norte y Huetar Atlántica; y con los de Peres et al. (2002) en Brasil y Chung et al. (2010) en Taiwán; quienes determinaron queC. gloeosporioideses el agente causal de la antracnosis en banano.
Colletotrichum musaeha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano, con base en su especificidad por el hospedante (Peres et al. 2002, Lima et al. 2003, Hernández 2009, Jeger et al. 1995). Sin embargo, análisis filogenéticos recientes indican queC. musaeyC. gloeosporioidesson co-específicas, es decir no se diferencian como especie una de la otra (Moriwaki et al. 2002 y Du et al. 2005). En adición, Freeman y Katan (1997) señalan que la diferenciación de especies dentro del géneroColletotrichumcon base en el hospedante no es un criterio confiable. Por otra parte,C. gloeosporioidesha sido definida como una especie compuesta por aislamientos que difieren fisiológicamente, con algunos más virulentos hacia ciertos hospedantes que otros (Suzuki et al. 2010). Recientemente, Medeiros et al. (2010) demostraron la variabilidad intraespecífica presente enC. gloeosporioides, con la técnica ISSR (Secuencia entre Repeticiones Simples), que consiste en la amplificación mediante PCR del fragmento ubicado entre los microsatélites. Aislamientos deC. gloeosporioidesprovenientes de diferentes hospedantes, cebolla, mango, marañón, se agruparon de acuerdo al hospedante, lo que indica diferencia entre los aislamientos y especificidad por hospedante, dentro de la misma especie.
La evidencia recolectada a la fecha indica queC. musaees un linaje dentro deC. gloeosporioides, con especificidad hacia frutos de banano (Hernandez 2009). Por antigüedad en descripción y nomenclatura,C. gloeosporioidesdebe considerarse como la especie causante de la antracnosis en banano. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, aún se mantiene aC. musaecomo el agente causal de la antracnosis del banano (Niroshini y Karunaratne 2009, De Lapeyre de Bellaire et al. 2010); posiblemente hasta determinar si otras regiones del genoma permiten separar ambas especies y validar la taxonomía molecular dentro del géneroColletotrichum(Hyde et al. 2009, Shivas y Tan 2009, Phoulivong et al. 2010).
Por otra parte, se ha demostrado queColletotrichum gloeosporioideses una especie compleja que contiene varias especies genética y biológicamente separadas (por ejemplo,Colletotrichum asianum, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum gloeosporioidessensu stricto, B. Weir y P.R. Johnst., Colletotrichum kahawae J.M. Waller y Bridge, and Colletotrichum siamense) y se ha denominado complejo ‘gloeosporioides’ (Phouli- vong et al. 2010).C. gloeosporioidessensu stricto incluiría a los aislamientos reconocidos comoC. gloeosporioides. De manera que cabe la posibilidad que los 2 pares de imprimadores utilizados en el presente estudio no sean específicos paraC. gloeosporioidessensu stricto sino que identifican a miembros del complejo ‘gloeosporioides’. Análisis filogenéticos basados en diferentes loci permitirán dilucidar esta situación.
Sensibilidad a fungicidas
Todos los aislamientos evaluados fueron sensibles al tiabendazol. Ningún aislamiento presentó unaCE50igual o superior a 1,0 ug.ml-1 , a partir de la cual los aislamientos se consideran insensibles al fungicida (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997). Este resultado contrasta con lo observado para aislamientos provenientes de zonas bananeras de producción intensiva para exportación tanto en Costa Rica (Hernández 2009) como en otros países (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997), donde se ha encontrado aislamientos insensibles al tiabendazol. Para Costa Rica, Hernández (2009) determinó que el porcentaje de aislamientos insensibles al tiabendazol varió de un 25 a un 66%, según la finca.
La pérdida de sensibilidad al tiabendazol ha sido asociada al uso de fungicidas del mismo grupo, benzimidazoles, para el combate de enfermedades en campo (pre-cosecha), particularmente benlate para el combate de la Sigatoka Amarilla (Mycosphaerella musae) (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997). Los aislamientos analizados provienen de una zona sin historial de aplicación de fungicidas en banano, a excepción de Atirro (FEIMA), lo que explicaría la ausencia de aislamientos con pérdida de sensibilidad al tiabendazol.
Aislamientos provenientes de áreas regularmente expuestas a los fungicidas muestran por lo general unaCE50mayor que la de aislamientos de zonas sin uso frecuente de fungicidas, debido a la presión de selección que ejerce el agroquímico (Wong et al. 2007). En algunos casos, la población puede volverse insensible al fungicida, lo que se refleja en el campo como falta de combate del patógeno (resistencia de campo), perdiéndose una estrategia de manejo de la enfermedad. Los aislamientos asociados a banano de altura en el cantón de Turrialba presentaron unaCE50promedio para el tiabendazol de 0,07 ug.ml-1 con un rango de 0,008-0,129 µg.ml-1 . Hernández (2009) determinó para aislamientos provenientes de un 50% de las fincas bananeras que analizó, unaCE50promedio superior a 3 µg.ml-1 . Una de las fincas ubicadas en el Valle la Estrella (Finca Río La Estrella) tuvo unaCE50 de 55 µg.m-1 .
Una proporción importante de aislamientos mostró una reducida sensibilidad al imazalil (80%) y al miclobutanil (100%). Este resulta- do concuerda con lo observado por Hernández (2009) para aislamientos deColletotrichumsp., recolectados de banano proveniente de zonas silvestres (sin aplicación de fungicidas) y plantaciones comerciales (con aplicación de fungicidas). Ambos fungicidas pertenecen al grupo de inhibidores de la desmetilación del esterol o en inglés “sterol demethylation inhibitors” (DMIs por sus siglas en inglés). Una correlación positiva entre la sensibilidad o pérdida de sensibilidad a fungicidas dentro de este grupo ha sido observada para diferentes patógenos, incluidos aislamientos del géneroColletotrichum(Wong et al. 2007, Sombardier et al. 2010).
La baja eficacia del imazalil sobre aislamientos deColletotrichumde banano no es sorpresiva; a pesar de su uso actual en el combate de enfermedades poscosecha del banano, antracnosis y pudrición de corona (Aked et al. 2001, Villalta et al. 2006, Demerutis et al. 2008). En 1997, De Lapeyre de Bellaire y Dubois, en Guadalupe, indicaron que el imazalil, a pesar de ser otro de los fungicidas aprobados para el combate de enfermedades poscosecha, no podía ser considerado como un reemplazo del tiabendazol por su baja eficacia en el control de Cmusae. Los resultados del presente trabajo y los de Hernández (2009) apoyan esta afirmación para las poblaciones costarricenses del agente causal de la antracnosis del banano.
El uso actual del imazalil, a pesar de la presencia de un alto porcentaje de aislamientos con sensibilidad reducida, puede estar asociado al hecho de que las dosis aplicadas para el combate de la enfermedad, entre 250 y 500 µg.ml-1 (Villalta et al. 2006), son lo suficientemente altas para proveer un adecuado combate tanto de los aislamientos sensibles como de aquellos con reducida sensibilidad. Una estrategia de combate con base en el uso de dosis de fungicidas del grupo DMIs relativamente altas ha sido propuesta por Koller y Scheinpflug (1987). Sin embargo, dosis muy altas pueden ser imprácticas y de costo elevado. Por otra parte, la alta proporción de aislamientos con sensibilidad reducida al imazalil indica que fallas en el combate de la enfermedad son previsibles en corto tiempo y que se está ante una situación crítica, cuya siguiente etapa es la resistencia práctica o de campo, si no se toman medidas anti-resistencia. Pérez et al. (2001) determinaron unaCE50promedio de 0,89 µg.ml-1 para aislamientos deC. musae. Esta población fue sensible al imazalil (línea base). Los aislamientos provenientes de banano de altura presentaron unaCE50promedio de 1,71 µg.ml-1 , aproximadamente el doble; con un 20% de aislamientos con unaCE50 promedio 3 veces mayor.
Para el miclobutanil, tanto laCE50pro- medio (3,987 µg.ml-1 ) como el factor de rango (FR: 5,88) de los aislamientos deColletotrichumasociados a banano de altura fueron casi idénticos a laCE50 promedio (3,8 µg.ml-1 ) y al FR (5,4) determinados por Wong et al. (2007) para aislamientos de C. cereale provenientes de zonas expuestas a fungicidas y con pérdida de sensibilidad. Aislamientos recolectados de áreas sin historial de uso del fungicida (línea base) presentaron unaCE50promedio de 0,72 µg.ml-1 en un rango de 0,19 a 1,30 µg.ml-1 . El FR para esta población fue de 7,2. En el presente trabajo solo los aislamientos de San Juan Sur mostraron unaCE50promedio y un rango similar, aunque ligeramente más alto, 1,10 (1,04–1,17) µg.ml-1 . El miclobutanil fue uno de los fungicidas DMI´s con menor actividad contra C. cereale, por lo que no se recomienda su uso en el combate de este patógeno (Wong et al. 2007).
Si se considera que no existe un registro o historial de uso de fungicidas en banano en el cantón de Turrialba, la baja sensibilidad de los aislamientos al imazalil y al miclobutanil podría estar asociada al uso de fungicidas del grupo DMIs en otros cultivos en la zona, a la inmigración de aislamientos con reducida sensibilidad desde otras áreas o a ambos.
La baja eficacia de los fungicidas imazalil y miclobutanil sobre la especie deColletotrichumasociada a banano llama a una revisión de su uso en el control de la antracnosis. Recientemente, fungicidas del grupo de las estrobirulinas han sido aprobados para su aplicación en banano en poscosecha con resultados promisorios (Schilder et al. 2001, Villalta et al. 2006).
Es recomendable establecer la línea base de sensibilidad a los fungicidas antes de su empleo a gran escala. Esta información puede ser utilizada posteriormente para evaluar cambios en sensibilidad de la población del patógeno blanco en los años siguientes. En el presente estudio, todos los aislamientos deC. gloeosporioides (C. musae) provenientes de banano de altura, en el cantón de Turrilaba, fueron sensibles al fungicida tiabendazol. No obstante, la población mostró un amplio rango de variación deCE50(FR: 16,12), lo que indica la posible existencia de aislamientos con sensibilidad reducida al fungicida.
De implementarse el uso de este fungicida en la zona, para el combate poscosecha de la antracnosis en banano, deben emplearse estrategias para limitar la selección de cepas insensibles. En adición, los datos presentados pueden ser utilizados para monitorear los cambios en sensibilidad de la población de esta zona en los próximos años. Además como población referencia (no expuesta al fungicida) en estudios de comparación de sensibilidad con poblaciones en contacto frecuente con el fungicida o fungicidas del mismo grupo. Por ejemplo, poblaciones del patógeno provenientes de plantaciones comerciales para exportación, como las ubicadas en la zona Atlántica de Costa Rica.
A la fecha, el método de combate más eficaz contra la antracnosis del banano es el químico, basado en la aplicación de fungicidas, principalmente tiabendazol. Sin embargo, el cobate químico enfrenta una serie de problemas y limitaciones como la selección de cepas insensibles al fungicida en diferentes partes del mundo (incluida Costa Rica), la eficiencia del fungicida (que varía en función de la época y la zona de producción); preocupaciones en relación con la contaminación del medio ambiente; y finalmente, los consumidores son muy selectivos y prefieren productos que no hayan sido expuestos a agroquímicos, particularmente en poscosecha (Lassois et al. 2010).
Este panorama plantea la necesidad de establecer nuevas estrategias no químicas de combate como: medidas preventivas en el campo y en las empacadoras, técnicas de almacena- miento, métodos físicos y biológicos de combate (Carré et al. 2006, Niroshini y Karunaratne
2009, Lassois et al. 2010, Maqbool et al. 2010); algunas de las cuales ya se implementan o eva- lúan en plantaciones de banano para exportación en Costa Rica (Demerutis et al. 2008). Para la producción de banano de altura en el cantón de Turrialba, urge investigar la implementación de estas medidas de combate, si se desea obtener un producto de calidad tanto para exportación como para mercado local.
Eduardo Salazar1/*+, Ramses Hernández**+, Ana Tapia***+, Luis Gómez-Alpízar****+
*Dirección para correspondencia:
Resumen
La antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum spp., es una de las principales enfermedades poscosecha que afectan el fruto del banano. En el presente experimento, 25 aislamientos de Colletotrichum spp., obtenidos de frutos de banano provenientes de 5 zonas del cantón de Turrialba, Costa Rica, fueron utilizados para caracterizar molecularmente al hongo y evaluar su sensibilidad in vitro a 3 fungicidas poscosecha: tiabendazol, imazalil y miclobutanil. La identificación molecular de cada uno de los aislamientos se realizó mediante la técnica PCR con los imprimadores especie-específicos de la región ITS (CgInt/ITS5) y de una región del gen de la ß-tubulina (TBCG/ TB5). Para las pruebas de sensibilidad in vitro a los 3 fungicidas, se utilizaron las siguientes concentraciones: 0,1; 1,0; 10,0 y 100,0 µg.ml-1. El análisis de la región ITS y de la región del gen de la β-tubulina, indicó que los aislamientos analizados corresponden a la especie Colletotrichum gloeosporioides. En cuanto a las pruebas de sensibilidad in vitro, todos los aislamientos fueron sensibles al tiabendazol, mientras que existe una marcada insensibilidad al imazalil y al miclobutanil.
Palabras clave: Antracnosis, PCR, poscosecha, tiabendazole, imazalil, miclobutanil
Abstract
Molecular identification of the fungus Colletotrichum spp., isolated from banana (Musa spp) in high lands from Turrialba and determination of their sensitivity to postharvest fungicides. Anthracnose is one of the most serious banana post-harvest diseases. A total of 25 Colletotrichum isolates were obtained from banana fruits grown in 5 areas in Turrialba County, Costa Rica; 5 isolates per area. Isolates were characterized on the basis of polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers of the ITS region and ß-tubulin, gene, and their in vitro sensitivities to the fungicides thiabendazole, imazalil and myclobutanil at 0.1, 1.0, 10.0 y 100.0 µg.ml-1. All isolates were identified as Colletotrichum gloeosporioides and were sensitive to thiabendazole, whereas most isolates showed a marked reduction in sensitivity to imazalil and myclobutanil.
Keywords: Anthracnose, PCR, postharvest, thiabendazole, imazalil, miclobutanil.
Introducción
El cultivo del banano (Musa spp) es una fuente importante de trabajo e ingresos en los países donde se produce. En Costa Rica, el banano se cultiva en forma comercial en zonas de alta precipitación y temperatura promedio de 30°C, ubicadas hasta los 300 msnm. Actualmente existe interés en la producción de banano en áreas localizadas a mayores altitudes, entre 440 y 1300 msnm (banano de altura), ya que la fruta tiene un sabor más dulce (A. Tapia 2009. Comunicación personal, Ramírez 2010); esto debido a que su ciclo de producción es más prolongado y se da una mayor acumulación de almidones que posteriormente son desdoblados en azúcares durante la maduración. Adicionalmente puede haber una mayor acumulación de fructosa que es 5 veces más dulce que la glucosa. La fruta proveniente de estas áreas podría comercializarse en los mercados como un producto diferenciado, eventualmente a un mayor precio. Junto con la mejora en el sabor de la fruta, también se busca que sea producida bajo un esquema de reducción o no uso de fungicidas, dada la preferencia creciente de los consumidores por productos obtenidos sin el uso de agroquímicos. Sin embargo, la fruta producida bajo este esquema de no uso de agroquímicos, puede presentar mayores daños por patógenos en poscosecha, favorecidos por la edad de cosecha y por el tiempo transcurrido desde su cosecha hasta alcanzar el mercado final de destino (Alvindia y Natsuaki 2008). En Costa Rica, la información disponible para banano de altura sobre los daños poscosecha y los patógenos asociados es limitada.
La antracnosis es una de las principales enfermedades poscosecha del banano e influye significativamente en la calidad de la fruta mercadeable. Los síntomas se presentan como lesiones ovaladas, oscuras y hundidas, con presencia de acérvulos (masas de esporas). La infección del fruto ocurre normalmente en campo durante su desarrollo; pero permanece latente hasta que el fruto madura (Raut y Ranade 2004), por lo que los síntomas se manifiestan mayormente durante el almacenamiento y muchas veces en los supermercados. La antracnosis es más severa si el fruto sufre heridas o lesiones como resultado de un mal manejo de la fruta.
Colletotrichum musae(Berk and Curtis) Arx ha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano con base en descripciones morfológicas y el alto grado de especificidad por el hospedante. Sin embargo, existe evidencia que aislamientos deColletotrichumprovenientes de un mismo hospedante pueden pertenecer a diferentes especies, por lo que el criterio de especificidad por hospedante para la identificación del agente causal de la enfermedad es inapropiado y genera confusión (Peres et al. 2002, Lima et al. 2003, Hernández 2009, Jeger et al. 1995, Pholivong et al. 2010). Una variabilidad morfológica y patogénica entre aislamientos deC. musaeha sido observada y se ha demostrado la existencia de razas fisiológicas o biotipos (Moriwaki et al. 2002, Peres et al. 2002, Ureña et al. 2002, Guerber et al. 2003, Liu et al. 2007). Análisis filogenéticos recientes indican queC. musaey C. gloeosporoides son conspecíficas; es decir una misma especie (Du et al. 2005, Hernández 2009). Phoulivong et al. (2010) determinaron que aunque C. gloeosporoides yC. acutatumhan sido consideradas las especies responsables de la antracnosis en frutos tropicales, ninguna de estas especies fue identificada como el agente causal de la enfermedad en Laos y Tailandia. Su estudio incluyó 25 aislamientos provenientes de guayaba, mango, papaya, y banano, entre otros.
Actualmente, el combate de la antracnosis en banano se basa en la aplicación de fungicidas poscosecha; específicamente el tiabendazol e imazalil (Villalta et al. 2006, Guzmán y Villalta 2008), así como la implementación de prácticas culturales en campo y en la planta empacadora para la reducción del inóculo. Otros 2 fungicidas registrados para uso poscosecha en banano son el miclobutanil y la azoxistrobina (Villalta et al. 2006, Guzmán y Villalta 2008).
Estos fungicidas son considerados de sitio específico, e inhiben un proceso particular del metabolismo del patógeno. El uso de fungicidas de este tipo enfrenta el problema de la selección de individuos resistentes en la población del patógeno blanco (Hernández 2009), que resulta en una disminución en la eficacia de los productos y una pérdida de esta estrategia de combate.
El cantón de Turrialba, provincia de Cartago, posee las condiciones agroclimáticas, así como disponibilidad de mano de obra, vías de comunicación, cercanía a un puerto, entre otras, que le confieren el potencial para la producción de banano de altura. En la zona existen algunas plantaciones de banano con las variedades Gros Mitchel y Congo.
El objetivo de esta investigación fue determinar la(s) especie(s) deColletotrichumasociada(s) con la antracnosis en frutos de banano (Musaspp) de altura en el cantón de Turrialba y su sensibilidad a los fungicidas tiabendazol, imazalil y miclobutanil.
Materiales y Métodos
Material vegetal
En la presente investigación se recolectaron racimos de banano de las variedades Gros Michel y Congo en 5 zonas del cantón de Turrialba, Cartago, ubicadas entre los 440 y los 1160 msnm; por lo que se considera banano de altura (Cuadro 1).
Los racimos recolectados tenían un calibre entre 38 y 40 32avos de pulgada en el dedo central de la segunda mano de arriba hacia abajo. Una vez seleccionados, los racimos se “desmanaron” y empacaron en bolsas plásticas con papel húmedo en su interior y luego se colocaron en cajas plásticas para su transporte. Cada caja se identificó con la zona de procedencia y la fecha de muestreo. Las cajas plásticas se colocaron en una cámara de almacenamiento con una tempera- tura de 25°C y una humedad relativa del 95% con la finalidad de promover la maduración natural de los frutos y la aparición de los síntomas de la enfermedad. Las cajas se revisaron cada 2 días para verificar la presencia de signos (acérvulos) del patógeno. Los aislamientos se realizaron en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad de Costa Rica Sede del Atlántico (Turrialba). Se escogieron 5 aislamientos para cada una de las 5 zonas del cantón de Turrialba, provincia de Cartago (Figura.1).
Obtención de aislamientos monospóricos
Con ayuda de una aguja de disección estéril se rasparon las lesiones sobre la cáscara de los frutos de banano que presentaban una cantidad visible de acérvulos y se colocó el raspado en un erlenmeyer con 25 ml de agua destilada estéril. Posteriormente, se tomó una alícuota de 10 µl y se colocó en una caja Petri con medio de cultivo Agar-Agua (BactoiMAgar. Difco, Le Pont de Claix, Francia) enmendado con 0,5 g.l-1 de cloranfenicol para evitar el crecimiento de bacterias.
La suspensión de esporas se distribuyó sobre la superficie de la caja Petri con ayuda de un asa, con el fin de que las esporas quedaran suficientemente separadas. Posteriormente, las cajas Petri se colocaron en una incubadora por 14 h aproximadamente, a una temperatura de 24ºC. Transcurrido este tiempo y con ayuda de un estereoscopio se identificaron las esporas ligeramente germinadas y se procedió a transferir las esporas individuales a nuevas cajas Petri con el medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar, PDA. Difco, Le Pont de Claix, Francia) enmendado con cloranfenicol 0,5 g.l-1 para evitar el crecimiento bacterial. Una espora por caja Petri. Las cajas Petri se colocaron en una incubadora con una temperatura entre 24 y 26ºC por 8 días.
Identificación molecular
Extracción de ADN del hongo
La extracción de ADN se hizo a partir del micelio de cada uno de los 25 cultivos monospóricos (monoconidiales) obtenidos. La extracción del ADN se realizó mediante el protocolo descrito por Rogers y Bendich (1988) con algunas modificaciones.
Identificación de especies mediante imprimadores específicos
Para la identificación de las especies deColletotrichumasociadas a la antracnosis de banano de altura se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para la amplificación con imprimadores o iniciadores específicos de 2 regiones genómicas: 1. la región de los espaciadores internos transcritos, ITS (Internal Transcribed Spacers, ITS1-5.8S-ITS2, por sus siglas en inglés), del ADN ribosomal (ADNr) y 2. una porción del gen de la β-Tubulina 2.
Para la amplificación de la región ITS se usaron los imprimadores CgInt (5’GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG3’) paraC. gloeosporioidesy CaInt2 (5’GGGGAAGCCTCTCGCGG3’), paraC. acutatum, combinados con el imprimador universal ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’). Las combinaciones de imprimadores fueron CgInt e ITS4 y CaInt2 e ITS4 (Sreenivasaprasad et al. 1996), respectivamente. La porción del gen de la β-Tubulina 2 se amplificó con los imprimadores específicos TBCG (C. gloeosporioides, 5’ CGGAAGCCTGGGTAGGAGCG 3’) y TBCA (C. acutatum, 5’ CGGAGGCCTGGTT- GGGTGAG 3’), combinados con el imprimador TB5 (5’GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTT3’) (Valero et al. 2010). Cada par de imprimadores se empleó de manera independiente.
Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 µl, la mezcla consistió en: 2,5 µl de Dreamtaq buffer 10X, 1,6 µM de cada imprimador, 1,7 mM de MgCl2, 0,16 mM de dNTPs, 0,4 mg.ml-1 BSA, 1,5 UTaqPolimerasa (Fermentas), aproximadamente 30 ng de ADN molde y agua nanopura estéril. La amplificación se realizó en un termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler con el siguiente programa térmico (ITS/ β-Tubulina): desnaturalización inicial a 94ºC por 3/5 min; 25/30 ciclos de desnaturalización a 94ºC, por 30/45 s, alineamiento a 57ºC/62ºC por 60/30 s; extensión inicial a 72ºC por 45/120 s; y una extensión final de 72ºC por 5/7 min. En todos los casos se incluyó controles positivos paraC. gloeosporioides y C. acutatum, así como un control negativo (sin ADN). El producto de PCR se analizó por electroforesis en geles de agarosa al 1% en 0,5X TBE buffer (Tris 10mM, Borato 20 mM, EDTA 1mM) con GelRed (2 µl/50ml). Las condiciones de la electroforesis fueron 80 voltios por 90 min. Para visualizar el producto de PCR, luego de la electroforesis los geles se colocaron en un transiluminador Kodak EDAS 290.
Evaluación de la sensibilidad in vitro a 3 fungicidas
Para cada fungicida, Mertec 50 SC (ia. tiabendazol), Magnate 75 SG (ia. imazalil) y Rally 40 WP (ia. miclobutanil), se preparó una solución madre a 2000 µg.ml-1 , a partir de la cual se obtuvo las concentraciones a evaluar. El medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA. Difco, Le Pont de Claix, Francia) fue enmendado con una alícuota de la solución madre de manera que se obtuviera las siguientes concentraciones: 0,0; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0 µg.ml-1 .
De cada aislamiento (25 en total) se toma- ron discos de 8 mm de diámetro del borde de una colonia de 7 días de establecida en medio PDA, como se describió anteriormente. Los discos se colocaron en el centro de las placas Petri en forma invertida, de manera que el micelio quedara en contacto directo con el medio PDA enmendado con cada uno de los fungicidas. Para cada aislamiento y concentración de fungicida se prepararon 4 placas Petri. Las placas Petri se incubaron a una temperatura entre 22ºC y 24ºC durante 8 días, posteriormente se midió el diámetro de la colonia del hongo en forma horizontal y vertical (diámetro más largo y más corto), y se calculó el promedio para cada aislamiento en cada tratamiento.
Análisis de los datos
Evaluación in vitro de la sensibilidad del crecimiento micelial del hongoColletotrichumsp., a 3 fungicidas poscosecha.
La sensibilidad de cada aislamiento a los fungicidas se evaluó con base en la CE50(Concentración Efectiva Media), la concentración del fungicida que reduce el diámetro de la colonia en un 50% en el medio de cultivo enmendado con fungicida en relación con el crecimiento en el medio de cultivo sin fungicida. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fue determinado mediante la fórmula propuesta por Cole et al. (2005):
Para obtener los valores deCE50correspondiente a la concentración de cada fungicida, los valores promedio de inhibición de crecimiento micelial se graficaron contra el logaritmo de las concentraciones del fungicida y se determinó la regresión lineal. El logaritmo de laCE50se calculó basadao en la intercepción con el eje ´´x´´ que corresponde al valor del 50% de inhibición en la regresión lineal. Los valores de laCE50se calcularon como el antilogaritmo del resultado obtenido del logaritmo. Es decir, se reemplazó el valor “50” en las ecuaciones resultantes que relacionan la variable respuesta, el porcentaje de inhibición (y), con el logaritmo de la concentración del fungicida y se calculó el antilogaritmo.
Se empleó un diseño irrestricto al azar con un arreglo factorial 5x3x5 correspondiente a 5 zonas muestreadas, 3 fungicidas (Mertec 50 SC, Magnate 75 SG, Rally 40 WP) y 5 concentraciones de cada uno de los fungicidas (0,0; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0 ppm), con 4 repeticiones. Cada unidad experimental consistió de una caja Petri. Se comparó el valor medio de laCE50entre fungicidas para los 25 aislamientos y entre zonas muestreadas para cada fungicida con el programa Infostat Software Estadístico Versión 2008.
Resultados
Caracterización molecular
La amplificación del ADN, mediante PCR, con los imprimadores especie-específicos paraC. gloeosporioides(CgInt) en combinación con el imprimador universal ITS4, produjo un producto de PCR de aproximadamente 450 pb para los 25 aislamientos recolectados en las 5 zonas productoras de banano de altura del cantón de Turrialba; así como para el aislamiento control deC. gloeosporioides(+Cg), proveniente de frutos de papaya. Un ejemplo de los productos de PCR obtenidos se muestra en laFigura 2. No se obtuvo producto de amplificación con el aislamiento control deC. acutatum(+Ca). Un producto de PCR de aproximadamente 500 pb se obtuvo para el aislamiento controlC. acutatum(+Ca), cuando se empleó el par de imprimadores CaInt2 (específico paraC. acutatum) e ITS4; mientras que no hubo producto de amplificación para los aislamientos provenientes de banano de altura (Figura.3), ni para el control deC. gloeosporioides. En ambos casos, el tamaño de los productos de PCR corresponden al esperado con los imprimadores especie- específicos, 450 pbC. gloeosporioides y 500 pb C. acutatum, respectivamente (Sreenivasaprasad et al. 1996).
La amplificación del ADN de los 25 aislamientos provenientes de banano de altura con los imprimadores especie-específicos TBCG (C. gloeosporioides) yTBCA (C. acutatum), en combinación con el imprimador TB5, correspondientes a una región del gen de la β-tubulina, coincidió con los resultados anteriores. Un pro- ducto de PCR de aproximadamente 350 pb se observó para todos los aislamientos provenientes de banano y para el aislamiento control deC. gloeosporioides(+Cg), cuando se empleó el par de imprimadores TBCG y TB5; en tanto que no se obtuvo amplificación para el aislamiento con- trol deC. acutatum(+Ca). LaFigura 4muestra un ejemplo de los productos de PCR obtenidos con los imprimadores TBCG y TB5. Para el aislamiento control deC. acutatum(+Ca), un producto de PCR de aproximadamente 350 pb se produjo con la combinación de imprimadores TBCA y TB5, en tanto que para ninguno de los aislamientos de banano de altura o el control deC. gloeosporioides(+Cg) se observó producto de PCR (Figura 5). En ambos casos, el tamaño de los productos de PCR corresponden al esperado con estos imprimadores especie-específicos, 350 pbC. gloeosporioides y 350 pb C. acutatum (Valero et al. 2010).
Sensibilidad del crecimiento micelial del hongoColletotrichumsp., a los fungicidas tiabendazol, imazalil y miclobutanil
La CE50promedio para los 25 aislamientos varió significativamente (p<= 0,01) entre los 3 fungicidas evaluados (Cuadro 2). El fungicida tiabendazol presentó laCE50en sensibilidad lo presentó el tiabendazol con 16,12 veces de diferencia entre laCE50más alta y la más baja (FR). Imazalil y miclobutanil presentaron un FR similar 4,69 y 5,88 veces, respectivamente.
La frecuencia de aislamientos según suCE50se presenta en la Figura 6. Para los fun- gicidas tiabendazol e imazalil, los valores de promedio más baja 0, 072 µg.ml-1 , un rango deCE50presentaron una distribución unimodal; 0,008 a 0,129 µg.ml-1 , seguido por el imazalil (1,70 µg.ml-1 dentro de un rango de 0,06 a 5,10 µg.ml-1 ) y el miclobutanil (3,98 µg.ml-1 , en un rango de 1,07 a 6,30 µg.ml-1 ). El mayor rango mientras que para el miclobutanil se observó una distribución bimodal. Para el tiabendazol, todos los aislamientos presentaron valores promedio deCE50menores a 0,55 µg.ml-1 mientras que para el imazalil el 80% de los aislamientos mostró valores entre 1,0 y 3,0 µg.ml-1 y para el miclobutanil el 80% entre 3,0 y 7,0 µg.ml-1 .
En relación con las 5 zonas muestreadas, se observaron diferencias significativas (p≤0,01) para laCE50promedio entre zonas para cada fungicida y entre fungicidas para cada zona (Cuadro 3). Piedras Redondas presentó los valores más bajos deCE50para los fungicidas tiabendazol e imazalil (0,04 y 1,13 mg.l-1 respectivamente); mientras que para las otras zonas, el valor de laCE50dependió del fungicida. Algunas zonas, San Juan Sur por ejemplo, presentó el valor más alto deCE50para un fungicida (imazalil; 2,28 mg.l-1 ) y el más bajo para otro (miclobutanil; 1,10 mg.l-1 ).
Discusión
Al igual que los bananos producidos comercialmente en las zonas costeras, el banano producido en el cantón de Turrialba (banano de altura) y cultivados bajo un sistema de no aplicación de fungicidas también es afectado por la antracnosis, lo que podría limitar su comercialización como producto fresco de exportación. En Filipinas, pequeños productores cultivan banano cerca de sus casas sin la aplicación de fungicidas en pre o poscosecha, los cuales son exportados a Japón, donde los consumidores prefieren este tipo de producto, sin embargo, la calidad de los frutos al llegar al mercado final es muy pobre debido a las enfermedades poscosecha, entre ellas la antracnosis, con una incidencia del 83% (Alvindia y Natsuaki 2008).
Identificación molecular
La amplificación del ADN, mediante PCR con imprimadores específicos paraC. gloeosporioides y C. acutatum, tanto de la región ITS como para una porción del gen de la β-tubulina, indicó que los 25 aislamientos deColletotrichumspp., obtenidos de banano de altura en el cantón de Turrialba, corresponden a la especieC. gloeosporioides. Para ambas regiones se obtuvo un producto de PCR con los imprimadores específicos paraC. gloeosporioidespara los aislamientos provenientes de banano y el aislamiento control de (C. gloeosporioides) proveniente de papaya; pero no cuando se utilizó imprimadores específicos paraC. acutatum. Con estos últimos se obtuvo amplificación únicamente para el aislamiento control deC. acutatum. El tamaño de producto de PCR fue de 450 pb para CgInt /ITS4 y 350 pb para TBCG /TB5, correspondiente al tamaño esperado para la amplificación con estos imprimadores de ADN perteneciente aC. gloeosporioides(Sreenivasaprasad et al. 1996, Valero et al. 2010). Ambos pares de imprimadores se han utilizado ampliamente para la confirmación deC. gloeosporioidescomo el agente causal de la antracnosis en diferentes hospedantes, incluidos frutos tropicales como, mango, marañón y papaya (Sreenivasaprasad y Talhinhas 2005, Medeiros et al. 2010).
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Hernández (2009), para aislamientos costarricenses provenientes de fincas de banano para exportación, ubicadas en las zonas Huetar Norte y Huetar Atlántica; y con los de Peres et al. (2002) en Brasil y Chung et al. (2010) en Taiwán; quienes determinaron queC. gloeosporioideses el agente causal de la antracnosis en banano.
Colletotrichum musaeha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano, con base en su especificidad por el hospedante (Peres et al. 2002, Lima et al. 2003, Hernández 2009, Jeger et al. 1995). Sin embargo, análisis filogenéticos recientes indican queC. musaeyC. gloeosporioidesson co-específicas, es decir no se diferencian como especie una de la otra (Moriwaki et al. 2002 y Du et al. 2005). En adición, Freeman y Katan (1997) señalan que la diferenciación de especies dentro del géneroColletotrichumcon base en el hospedante no es un criterio confiable. Por otra parte,C. gloeosporioidesha sido definida como una especie compuesta por aislamientos que difieren fisiológicamente, con algunos más virulentos hacia ciertos hospedantes que otros (Suzuki et al. 2010). Recientemente, Medeiros et al. (2010) demostraron la variabilidad intraespecífica presente enC. gloeosporioides, con la técnica ISSR (Secuencia entre Repeticiones Simples), que consiste en la amplificación mediante PCR del fragmento ubicado entre los microsatélites. Aislamientos deC. gloeosporioidesprovenientes de diferentes hospedantes, cebolla, mango, marañón, se agruparon de acuerdo al hospedante, lo que indica diferencia entre los aislamientos y especificidad por hospedante, dentro de la misma especie.
La evidencia recolectada a la fecha indica queC. musaees un linaje dentro deC. gloeosporioides, con especificidad hacia frutos de banano (Hernandez 2009). Por antigüedad en descripción y nomenclatura,C. gloeosporioidesdebe considerarse como la especie causante de la antracnosis en banano. Sin embargo, desde un punto de vista práctico, aún se mantiene aC. musaecomo el agente causal de la antracnosis del banano (Niroshini y Karunaratne 2009, De Lapeyre de Bellaire et al. 2010); posiblemente hasta determinar si otras regiones del genoma permiten separar ambas especies y validar la taxonomía molecular dentro del géneroColletotrichum(Hyde et al. 2009, Shivas y Tan 2009, Phoulivong et al. 2010).
Por otra parte, se ha demostrado queColletotrichum gloeosporioideses una especie compleja que contiene varias especies genética y biológicamente separadas (por ejemplo,Colletotrichum asianum, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum gloeosporioidessensu stricto, B. Weir y P.R. Johnst., Colletotrichum kahawae J.M. Waller y Bridge, and Colletotrichum siamense) y se ha denominado complejo ‘gloeosporioides’ (Phouli- vong et al. 2010).C. gloeosporioidessensu stricto incluiría a los aislamientos reconocidos comoC. gloeosporioides. De manera que cabe la posibilidad que los 2 pares de imprimadores utilizados en el presente estudio no sean específicos paraC. gloeosporioidessensu stricto sino que identifican a miembros del complejo ‘gloeosporioides’. Análisis filogenéticos basados en diferentes loci permitirán dilucidar esta situación.
Sensibilidad a fungicidas
Todos los aislamientos evaluados fueron sensibles al tiabendazol. Ningún aislamiento presentó unaCE50igual o superior a 1,0 ug.ml-1 , a partir de la cual los aislamientos se consideran insensibles al fungicida (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997). Este resultado contrasta con lo observado para aislamientos provenientes de zonas bananeras de producción intensiva para exportación tanto en Costa Rica (Hernández 2009) como en otros países (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997), donde se ha encontrado aislamientos insensibles al tiabendazol. Para Costa Rica, Hernández (2009) determinó que el porcentaje de aislamientos insensibles al tiabendazol varió de un 25 a un 66%, según la finca.
La pérdida de sensibilidad al tiabendazol ha sido asociada al uso de fungicidas del mismo grupo, benzimidazoles, para el combate de enfermedades en campo (pre-cosecha), particularmente benlate para el combate de la Sigatoka Amarilla (Mycosphaerella musae) (De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997). Los aislamientos analizados provienen de una zona sin historial de aplicación de fungicidas en banano, a excepción de Atirro (FEIMA), lo que explicaría la ausencia de aislamientos con pérdida de sensibilidad al tiabendazol.
Aislamientos provenientes de áreas regularmente expuestas a los fungicidas muestran por lo general unaCE50mayor que la de aislamientos de zonas sin uso frecuente de fungicidas, debido a la presión de selección que ejerce el agroquímico (Wong et al. 2007). En algunos casos, la población puede volverse insensible al fungicida, lo que se refleja en el campo como falta de combate del patógeno (resistencia de campo), perdiéndose una estrategia de manejo de la enfermedad. Los aislamientos asociados a banano de altura en el cantón de Turrialba presentaron unaCE50promedio para el tiabendazol de 0,07 ug.ml-1 con un rango de 0,008-0,129 µg.ml-1 . Hernández (2009) determinó para aislamientos provenientes de un 50% de las fincas bananeras que analizó, unaCE50promedio superior a 3 µg.ml-1 . Una de las fincas ubicadas en el Valle la Estrella (Finca Río La Estrella) tuvo unaCE50 de 55 µg.m-1 .
Una proporción importante de aislamientos mostró una reducida sensibilidad al imazalil (80%) y al miclobutanil (100%). Este resulta- do concuerda con lo observado por Hernández (2009) para aislamientos deColletotrichumsp., recolectados de banano proveniente de zonas silvestres (sin aplicación de fungicidas) y plantaciones comerciales (con aplicación de fungicidas). Ambos fungicidas pertenecen al grupo de inhibidores de la desmetilación del esterol o en inglés “sterol demethylation inhibitors” (DMIs por sus siglas en inglés). Una correlación positiva entre la sensibilidad o pérdida de sensibilidad a fungicidas dentro de este grupo ha sido observada para diferentes patógenos, incluidos aislamientos del géneroColletotrichum(Wong et al. 2007, Sombardier et al. 2010).
La baja eficacia del imazalil sobre aislamientos deColletotrichumde banano no es sorpresiva; a pesar de su uso actual en el combate de enfermedades poscosecha del banano, antracnosis y pudrición de corona (Aked et al. 2001, Villalta et al. 2006, Demerutis et al. 2008). En 1997, De Lapeyre de Bellaire y Dubois, en Guadalupe, indicaron que el imazalil, a pesar de ser otro de los fungicidas aprobados para el combate de enfermedades poscosecha, no podía ser considerado como un reemplazo del tiabendazol por su baja eficacia en el control de Cmusae. Los resultados del presente trabajo y los de Hernández (2009) apoyan esta afirmación para las poblaciones costarricenses del agente causal de la antracnosis del banano.
El uso actual del imazalil, a pesar de la presencia de un alto porcentaje de aislamientos con sensibilidad reducida, puede estar asociado al hecho de que las dosis aplicadas para el combate de la enfermedad, entre 250 y 500 µg.ml-1 (Villalta et al. 2006), son lo suficientemente altas para proveer un adecuado combate tanto de los aislamientos sensibles como de aquellos con reducida sensibilidad. Una estrategia de combate con base en el uso de dosis de fungicidas del grupo DMIs relativamente altas ha sido propuesta por Koller y Scheinpflug (1987). Sin embargo, dosis muy altas pueden ser imprácticas y de costo elevado. Por otra parte, la alta proporción de aislamientos con sensibilidad reducida al imazalil indica que fallas en el combate de la enfermedad son previsibles en corto tiempo y que se está ante una situación crítica, cuya siguiente etapa es la resistencia práctica o de campo, si no se toman medidas anti-resistencia. Pérez et al. (2001) determinaron unaCE50promedio de 0,89 µg.ml-1 para aislamientos deC. musae. Esta población fue sensible al imazalil (línea base). Los aislamientos provenientes de banano de altura presentaron unaCE50promedio de 1,71 µg.ml-1 , aproximadamente el doble; con un 20% de aislamientos con unaCE50 promedio 3 veces mayor.
Para el miclobutanil, tanto laCE50pro- medio (3,987 µg.ml-1 ) como el factor de rango (FR: 5,88) de los aislamientos deColletotrichumasociados a banano de altura fueron casi idénticos a laCE50 promedio (3,8 µg.ml-1 ) y al FR (5,4) determinados por Wong et al. (2007) para aislamientos de C. cereale provenientes de zonas expuestas a fungicidas y con pérdida de sensibilidad. Aislamientos recolectados de áreas sin historial de uso del fungicida (línea base) presentaron unaCE50promedio de 0,72 µg.ml-1 en un rango de 0,19 a 1,30 µg.ml-1 . El FR para esta población fue de 7,2. En el presente trabajo solo los aislamientos de San Juan Sur mostraron unaCE50promedio y un rango similar, aunque ligeramente más alto, 1,10 (1,04–1,17) µg.ml-1 . El miclobutanil fue uno de los fungicidas DMI´s con menor actividad contra C. cereale, por lo que no se recomienda su uso en el combate de este patógeno (Wong et al. 2007).
Si se considera que no existe un registro o historial de uso de fungicidas en banano en el cantón de Turrialba, la baja sensibilidad de los aislamientos al imazalil y al miclobutanil podría estar asociada al uso de fungicidas del grupo DMIs en otros cultivos en la zona, a la inmigración de aislamientos con reducida sensibilidad desde otras áreas o a ambos.
La baja eficacia de los fungicidas imazalil y miclobutanil sobre la especie deColletotrichumasociada a banano llama a una revisión de su uso en el control de la antracnosis. Recientemente, fungicidas del grupo de las estrobirulinas han sido aprobados para su aplicación en banano en poscosecha con resultados promisorios (Schilder et al. 2001, Villalta et al. 2006).
Es recomendable establecer la línea base de sensibilidad a los fungicidas antes de su empleo a gran escala. Esta información puede ser utilizada posteriormente para evaluar cambios en sensibilidad de la población del patógeno blanco en los años siguientes. En el presente estudio, todos los aislamientos deC. gloeosporioides (C. musae) provenientes de banano de altura, en el cantón de Turrilaba, fueron sensibles al fungicida tiabendazol. No obstante, la población mostró un amplio rango de variación deCE50(FR: 16,12), lo que indica la posible existencia de aislamientos con sensibilidad reducida al fungicida.
De implementarse el uso de este fungicida en la zona, para el combate poscosecha de la antracnosis en banano, deben emplearse estrategias para limitar la selección de cepas insensibles. En adición, los datos presentados pueden ser utilizados para monitorear los cambios en sensibilidad de la población de esta zona en los próximos años. Además como población referencia (no expuesta al fungicida) en estudios de comparación de sensibilidad con poblaciones en contacto frecuente con el fungicida o fungicidas del mismo grupo. Por ejemplo, poblaciones del patógeno provenientes de plantaciones comerciales para exportación, como las ubicadas en la zona Atlántica de Costa Rica.
A la fecha, el método de combate más eficaz contra la antracnosis del banano es el químico, basado en la aplicación de fungicidas, principalmente tiabendazol. Sin embargo, el cobate químico enfrenta una serie de problemas y limitaciones como la selección de cepas insensibles al fungicida en diferentes partes del mundo (incluida Costa Rica), la eficiencia del fungicida (que varía en función de la época y la zona de producción); preocupaciones en relación con la contaminación del medio ambiente; y finalmente, los consumidores son muy selectivos y prefieren productos que no hayan sido expuestos a agroquímicos, particularmente en poscosecha (Lassois et al. 2010).
Este panorama plantea la necesidad de establecer nuevas estrategias no químicas de combate como: medidas preventivas en el campo y en las empacadoras, técnicas de almacena- miento, métodos físicos y biológicos de combate (Carré et al. 2006, Niroshini y Karunaratne
2009, Lassois et al. 2010, Maqbool et al. 2010); algunas de las cuales ya se implementan o eva- lúan en plantaciones de banano para exportación en Costa Rica (Demerutis et al. 2008). Para la producción de banano de altura en el cantón de Turrialba, urge investigar la implementación de estas medidas de combate, si se desea obtener un producto de calidad tanto para exportación como para mercado local.
Referencias bibliográficas
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*Correspondencia:
Eduardo Salazar:
Biotek Agriculture Latinoamérica. San José, Costa Rica.
Autor para correspondencia. Correo electrónico: esalazar@biotek-agriculture.cr
Ramses Hernández:
Plant Pathology and Postharvest. Tropical Fruit
Ana Tapia:
Laboratorio de Fitopatología. Sede del Atlántico, Universidad de Costa Rica. Turrialba, Costa Rica.
Luis Gómez-Alpízar:
Centro de Investigaciones Agronómicas, Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica.
1Autor para correspondencia. Correo electrónico: esalazar@biotek-agriculture.cr
*Biotek Agriculture Latinoamérica. San José, Costa Rica.
**Plant Pathology and Postharvest. Tropical Fruit
***Laboratorio de Fitopatología. Sede del Atlántico, Universidad de Costa Rica. Turrialba, Costa Rica.
****Centro de Investigaciones Agronómicas, Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica.
Recibido: 12/10/11 Aceptado: 12/04/12
Fechas de Publicación
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Publicación en esta colección
03 Dic 2012 -
Fecha del número
Jun 2012
Histórico
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Recibido
12 Oct 2011 -
Acepto
12 Abr 2012
