Valoración diagnóstica de técnicas moleculares para detección de infección bucal por virus del papiloma humanoResúmenes
La infección por Virus del Papiloma Humano está considerada actualmente como la infección de transmisión sexual más frecuente en el mundo. Muchas veces, estas infecciones son asintomáticas, pasando desapercibidas a no ser que se empleen métodos moleculares. Otras infecciones se vuelven crónicas, siendo las que tienen mayor potencial oncogénico. <span name="style_bold">Desarrollo: </span>El virus se detectó en carcinoma bucal de células escamosas, así como en lesiones benignas de mucosa bucal, donde se encontró HPV de bajo y alto riesgo oncogénico. En mucosa bucal normal se identificaron diferentes tipos de HPV de alto riesgo oncogénico. Los estudios señalan que el hallazgo en mucosa sana depende del método de estudio empleado. No obstante, a pesar de la importancia del diagnóstico precoz, existe poca información respecto de la prevalencia en mucosa bucal sana. La infección por HPV puede diagnosticarse por diferentes métodos, pero no todos permiten detectar el genoma ni determinar el tipo viral involucrado. <span name="style_bold">Discusión: </span>La tipificación del HPV permite conocer tipos virales circulantes en una población, facilitando el desarrollo e implementación de programas de prevención, diagnóstico y tratamiento adecuados, por lo que la identificación de HPV de alto riesgo oncogénico debería realizarse rutinariamente. Si bien, los mejores métodos diagnósticos son las pruebas moleculares, debe considerarse la prevalencia geográfica para los diferentes tipos de HPV en la elección del método específico afín de evitar conclusiones inexactas.La tipificación del HPV permite conocer tipos virales circulantes en una población, facilitando el desarrollo e implementación de programas de prevención, diagnóstico y tratamiento adecuados, por lo que la identificación de HPV de alto riesgo oncogénico debería realizarse rutinariamente. Si bien, los mejores métodos diagnósticos son las pruebas moleculares, debe considerarse la prevalencia geográfica para los diferentes tipos de HPV en la elección del método específico afín de evitar conclusiones inexactas.
Métodos; Biología Molecular; Papiloma Virus Humano; Enfermedad de transmisión Sexual; Diagnóstico Bucal
The human papillomavirus (HPV) is now considered the most common sexually transmitted infection (STI) in the world. Often, these infections are asymptomatic, remaining unnoticed unless molecular methods are used. Other infections become chronic, with the greatest oncogenic potential. <span name="style_bold">Development: </span>The virus was detected in oral squamous cell carcinoma and benign lesions of oral mucosa, where high and low HPV oncogenic risk was found. In normal oral mucosa three different types of high oncogenic risk HPV were identified. Studies indicate that the finding of in healthy mucosa depends on the method of study employed. However, despite the importance of early diagnosis, there is little information on the prevalence in healthy oral mucosa. HPV infection can be diagnosed by different methods, but not all methods allow detection of the genome or allow determination of the viral type involved. <span name="style_bold">Discussion: </span>HPV typing can find viral types circulating in a population, facilitating the development and implementation of programs for prevention, diagnosis and treatment, so the identification of high cancer risk HPV should be performed routinely.Althoughthe bestdiagnosticmethods aremolecular testing, the geographical prevalence of different types of HPV should be considered in the choice of specific method in order to avoid inaccurate conclusions.HPV typing can find viral types circulating in a population, facilitating the development and implementation of programs for prevention, diagnosis and treatment, so the identification of high cancer risk HPV should be performed routinely.Althoughthe bestdiagnosticmethods aremolecular testing, the geographical prevalence of different types of HPV should be considered in the choice of specific method in order to avoid inaccurate conclusions.
methods; molecular biology; Human Papillomavirus; Sexually Transmitted Diseases; Diagnosis; Oral
1*, Marcelo Gabriel Medina2*, Luis Antonio Merino3*
Desarrollo: El virus se detectó en carcinoma bucal de células escamosas, así como en lesiones benignas de mucosa bucal, donde se encontró HPV de bajo y alto riesgo oncogénico.
Discusión: La tipificación del HPV permite conocer tipos virales circulantes en una población, facilitando el desarrollo e implementación de programas de prevención, diagnóstico y tratamiento adecuados, por lo que la identificación de HPV de alto riesgo oncogénico debería realizarse rutinariamente. Si bien, los mejores métodos diagnósticos son las pruebas moleculares, debe considerarse la prevalencia geográfica para los diferentes tipos de HPV en la elección del método específico afín de evitar conclusiones inexactas.
Palabras clave: Métodos, Biología Molecular, Papiloma Virus Humano, Enfermedad de transmisión Sexual, Diagnóstico Bucal (fuente: DeCS, BIREME)
Development: The virus was detected in oral squamous cell carcinoma and benign lesions of oral mucosa, where high and low HPV oncogenic risk was found. In normal oral mucosa three different types of high oncogenic risk
Discussion: HPV typing can find viral types circulating in a population, facilitating the development and implementation of programs for prevention, diagnosis and treatment, so the identification of high cancer risk HPV should be performed routinely.Althoughthe bestdiagnosticmethods aremolecular testing, the geographical prevalence of different types of HPV should be considered in the choice of specific method in order to avoid inaccurate conclusions.
Key words: methods, molecular biology, Human Papillomavirus, Sexually Transmitted Diseases, Diagnosis, Oral (source: MeSH, NLM)
(1). La gran mayoría de estas infecciones son asintomáticas o subclínicas, pasan desapercibidas a no ser que se empleen métodos moleculares para detectar fragmentos del genoma en las células infectadas. Casi todas las infecciones son transitorias, pues son controladas por la respuesta inmune, sólo entre el 10% y 20% de las mismas se vuelven crónicas o persistentes, siendo éstas las que tienen mayor potencial oncogénico (2). La infección por HPV puede diagnosticar se por diferentes métodos, pero sólo las técnicas moleculares permiten detectar con alta sensibilidad el genoma del virus y determinar el tipo viral involucrado en diferentes tipos de muestras como: células exfoliadas, tejidos embebidos en parafina o tumores frescos (3). La tipificación es importante en la prevención, diagnóstico, tratamiento y seguimiento más adecuado de pacientes (4). Los métodos moleculares de detección y/o identificación del ADN de HPV disponibles son: Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) y Sistema de Captura de Híbridos (SCH). La PCR puede combinarse con la hibridación o digestión enzimática de los productos de amplificación para la tipificación viral (5). Sin embargo, debe tenerse en cuenta la prevalencia geográfica para los diferentes tipos de HPV en la elección del método más específico (6). Teniendo en cuenta que existe discrepancia entre los autores, respecto de la determinación del método molecular de elección para la detección de la infección por HPV en cavidad bucal, se planteó el presente trabajo con el objeto de valorar las técnicas moleculares diagnósticas disponibles para la detección de la infección por HPV en cavidad bucal mediante la presente actualización de la evidencia científica.
(7).
En muestras provenientes de mucosa bucal normal se han podido identificar diferentes tipos de HPV de alto riesgo oncogénico (8). Los hallazgos señalan que en mucosa sana y en relación con el método de estudio es posible el hallazgo de HPV en el 13 al 40% de las muestras, con material obtenido por biopsias, citología exfoliativa (citobrush, hisopo o espátula) o por enjuague bucal (9). Asimismo, la persistencia de la infección por HPV en lesiones bucales, es importante más aún si se encuentran asociadas con hábitos que pueden afectar la mucosa bucal (10). La combinación de factores de riesgo podrían potenciar cambios celulares de lesiones clínicamente benignas con transformación premalignas y/o malignas de la cavidad bucal. No obstante, a pesar de la importancia del diagnóstico precoz, existe poca información respecto de la prevalencia de HPV en la mucosa bucal clínicamente sana (11). Asimismo, existen diferencias en los rangos de prevalencia de HPV de cavidad oral entre los estudios con PCR, dichas variaciones, aún confusas, se podrían deber a: método de recolección de muestras, baja carga viral de la muestras, diferentes sensibilidades de la PCR, en otros; lo que llevarían a conclusiones inexactas (12). Distintos investigadores, han usado la PCR con el fin de detectar y tipificar al HPV señalándola como la técnica más rápida y sensible para la detección del ADN viral (13).
Muestras biológicas: Recolección y conservación.
(14). La obtención de ADN de alta calidad escrítica para métodos genéticos-moleculares (15). Generalmente los métodos que no usan el paso de amplificación tal como la Captura de Híbridos de Segunda Generación (HC2) están menos afectados por estas variables, mientras que los procedimientos basados en PCR toleran menos las impurezas por su naturaleza enzimática. Por lo tanto, es necesario el uso de dispositivos que permitan la recolección de grandes cantidades de células de la muestra, como el citobrush, y medios de conservación y transporte que conservan la morfología de la célula y estabilizan el DNA y RNA (14).
(16). Se ha realizado detección de HPV a partir de diferentes tipos de muestras, como tejido de archivo (17) , tejido congelado (18), cepillado (19) , espátula de Ayre (19) e incluso frotis teñido (5).
(5). El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos de la muestra, tiene un efecto inverso sobre la eficacia de la PCR. Para la amplificación de ADN provenientes de material de archivo, se aconseja usar iniciadores que amplifiquen secuencias de ADN viral no superior a 200 pb (20). Una de las ventajas de la PCR es que se pueden analizar mediante este método tejidos de más de 40 años de antigüedad. Además es posible emplearla especialmente en aquellas lesiones de carácter atípico y de significado incierto (15).
(21). El tejido congelado es considerado una mejor fuente de ácidos nucleicos que el tejido fijado, ya que no es sometido a procedimientos que puedan introducir inhibidores de la PCR o provocar degradación del ADN (18). Algunos estudios señalan el cepillado como el mejor método para obtención de material para la detección de HPV con 100% de correlación con el diagnóstico morfológico de HPV (15). Existen estudios que compararon la eficacia de la citología de muestras de cepillado con muestras obtenidas mediante espátula o torundas de algodón y claramente se ha demostrado que la calidad de frotis para diagnóstico con cepillado es En cuanto a la conservación, algunos estudios señalan que se puede conservar la muestra hasta 30 días a temperatura ambiente. Otros establecen la adecuada conservación de la muestra a temperatura ambiente hasta una semana, a 4°C hasta un mes y -20°C indefinidamente (14).
(24).
Tipos de Pruebas Moleculares basadas en sondas con ácido nucleicos. Las pruebas basadas en sondas pueden dividirse en 2 grandes grupos: 1. Pruebas con señales químicas de visualización amplificada;
tabla 1, se señalan las pruebas moleculares más importantes.
tabla 2, se mencionan las ventajas, desventajas y/o limitaciones que presentan algunos de los procedimientos moleculares más usados.
Southern Blot (SB). Es considerado el “Standard de oro”. Las muestras con alta carga viral pueden ser analizadas en forma confiable por esta técnica, mientras los que tienen baja carga viral pueden ser analizados únicamente por técnicas muy sensibles.
Sistema de Captura de Híbridos (SCH). Proporciona una sensibilidad cercana a la PCR y detecta 13 tipos de HPV de alto riesgo (16,18,31,33,35,39,45,52,56,58,59,68) y 5 de bajo riesgo oncogénico (6,11,42-44). Esta estandarizado y es reproducible. No hay posibilidad de error durante el procesamiento porque el software invalida la corrida cuando los controles positivos y negativos reportan lecturas inesperadas. Según la literatura resulta un adecuado método para estudios epidemiológicos grandes por su reproductibilidad, buena sensibilidad y fácil muestreo (25). Este método no discrimina los diferentes tipos de HPV hallados en una infección múltiple (26). Esta metodología no resulta adecuada para el estudio de la infección por HPV en la cavidad bucofaríngea ya que existen asociaciones con genotipo de HPV como el 13 y 32 que no son detectados por el formato actual del sistema ya que no incluye las sondas específicas para estos tipos virales.
Hibridación in situ sobre muestras biológicas (HIS). Detecta HPV en células, asimismo permite demostrar el ADN de HPV directamente en la pieza histológica.
Hibridización in situ sobre filtro (HISF). Similar al Southern Blot pero de realización más sencillo. Además las muestras que tienen alta carga viral pueden ser analizadas en forma confiable por esta técnica.
(27). Los resultados obtenidos con las PCR están sujetos al nivel de detección de la prueba molecular, pues la cantidad de ADN del virus en la muestra puede resultar insuficiente, tanto por una baja carga viral presente, como por el lugar de toma de muestra biológica, lo que no permitiría la detección del genoma viral mediante este método (28). Algunos autores señalan que el límite de sensibilidad de la PCR es de 10 copias del ADN viral entre un millón de células.10 Otros, señalan que la distribución del ADN viral en las lesiones es focal, por lo que en células adyacentes que presentan los mismos cambios morfológicos, se pueden obtener resultados distintos en la detección de dicho ADN (29).
(6). De acuerdo a la literatura la sensibilidad y especificidad de los métodos PCR puede variar dependiendo solamente de las siguientes condiciones: métodos de muestreo; transporte; sets de primers; el tamaño de los productos de la PCR; condición de la reacción; funcionamiento del DNA polimerasa empleada en la reacción; procedimientos de extracción de ADN; cantidad de ADN de HPV amplificado y habilidad para detectar múltiples tipos (6,26). Muchos procedimientos están disponibles para evitar estos potenciales problemas empleando protocolos para detección de ADN de HPV. Todos los métodos basados en la PCR tienen limitaciones para la detección de infecciones múltiples debido al número de tipos de HPV detectables. Otro problema es la diferencia en la sensibilidad para distinguir tipos de HPV entre diferentes sistemas usados y la reproducibilidad de los diferentes métodos de HPV para la determinación del tipo exacto de HPV en la muestra.
PCR en Tiempo Real. La determinación de la carga viral es algo muy importante ya que existen estudios de correlación entre el porcentaje de la carga viral y el incremento de riesgo para el desarrollo de lesiones. Actualmente no hay consenso sobre el mejor método para cuantificar HPV en muestras biológicas. Uno de los métodos más exactos disponibles es la PCR tiempo real, pero está sujeta a variaciones. Siendo una técnica muy interesante para estudios epidemiológicos por la información brindada (40). Nested PCR. Varios autores han demostrado que el uso de la Nested PCR empleando consenso de primers es un medio de extremada sensibilidad en la detección de los conocidos y nuevos tipos de HPV (33).
(16). Debido a esto, se ha sugerido como un método molecular de gran utilidad en el diagnóstico y seguimiento de la presencia y persistencia del HPV de alto riesgo (20). El uso de la RFLP demostró ser útil en la identificación de múltiples infecciones de HPV tal como en la detección de nuevos tipos de HPV (30). Asimismo, esta técnica puede identificar al HPV 11 que es comúnmente hallado en mucosa oral (31). Además puede ser usada para la detección de los tipos de HPV más comunes de alto riesgo y aquellos no identificados por este método podrían ser identificados por secuenciación directa de los productos de PCR empleando los primers de la PCR interna (31).
(31).
Sistema de Primers PGMY 09/11. El sistema de Primers PGMY09/11 presenta una sensibilidad demostrada para la amplificación por PCR de 10 genomas de HPV. Según la literatura con este sistema se halló un incremento notable en la detección de múltiples infecciones y se logró amplificar ciertos tipos de HPV que fueron ineficientemente detectados usando otros métodos (32). Este sistema detecta el 90% de muestras con tipos múltiples de HPV (26).
(26).
Referencias bibliográficas
-
1. Rivera R, Delgado J, Prainel V, Barrero R, Larraín A. Mecanismos de infección y transformación neoplásica producido por virus papiloma humano en el epitelio cervical. Rev Chil Obstet Ginecol2006; 71: 135-140.
-
2. Moscicki AB, Schiffman M, Kjaer S, Villa LL, Chapter 5: Updating the natural history of HPV and anogenital cancer. Vaccine 2006; 24 (3): 42-51.
-
3. De Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, Zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology 2004; 324: 17-27.
-
4. Khan M, Castle P, Lorincz A, Wacholder S, Sherman M, Scott D, et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type –specific HPV testing in clinical practice. J Nat Cancer Inst 2005; 97: 1072-1079.
-
5. Jacobs MV, Zielinski D, Meijer CJ, Pol RP, VoorHorst FJ, De Schipper FA Et Al. A simplified and reliable HPV testing of archival Papanicolaou cervical smears: application to cervical smears from cancer starting with cytologicallynormal smears. Br J Cancer 2000; 82: 1421-6.
-
6. Iftner T, Villa LL. Chapter 12: Human Papillomavirus Technologies. Journal of the Cancer Institute Monographs 2003: 31: 80-88.
-
7. Correnti M, Rivera H, Cavazza ME. Detection of human papillomaviruses of high oncogenic potential in oral squamous cell carcinoma in a Venezuelan population. Oral Diseases2004; 10: 163-166.
-
8. Jiménez C, Correnti M, Salma N, Cavazza M, Perrone M. Detección del Virus Papiloma Humano en entidades clínicas benignas de la cavidad bucal mediante la reacción en cadena de la polimersasa e hibridación molecular. Acta Odontol Venez 2001; 39 (2): 1-6.
-
9. Gutierrez RA, Colacino MC, Picconi MA, Alonio V, Teysiée A, Keszler A. Detección y tipificación de HPV en lesiones orales. Dermatología Argentina 2006; XII (2): 114-118.
-
10. Gradilone A, Vercillo R, Napolitano M, Cardinal G, Gazzaniga P, Silvetre J, Gandinni O, Tomao S, Agliano AM. Prevalence of human papillomavirus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in the cérvix healthy women. J Med Virology 1996; 50: 1-4.
-
11. Kellokoski JK, Syrajenen SM, Chan F, Yliskoski M, Syrjanen KJ. Southern blot hybridization and PCR in detection of oral human papillomavirus (HPV) infections in women with genital HPV infections. J Oral Pathol Med 1992; 21: 459-64.
-
12. Shroyer KR, Greer RO. Detection of human papillomavirus DNA by in situ DNA hybridization and polymerase chain reaction in premalignant and malignant oral lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1991; 71(6), 708-713.
-
13. Meijer C, Snijders P, Castle P. Cinical utility of HPV genotyping. Gyn Oncol 2006; 103: 12-17.
-
14. Z. De Guglielmo, A. Rodríguez. Métodos utilizados en la identificación del virus de papiloma humano. An. Sist. Sanit. Navar. 2010; 33 (1): 71-77.
-
15. Melo AA, Roa EI, Montenegro HS, Capurro VI, Roa SJC. Estudio comparativo de detección del virus papiloma humano (VPH) en muestras citológicas y biopsias de cuello uterino. Rev Med Chile 2005; 133: 639-644.
-
16. García F, Barker B, Santos C, Brown EM, Nuno T, Giuliano A, et al. Cross-sectional sudy of patient and physician collected cytology and human papillomavirus. Obstet Gynecol 2003; 102: 266-72.
-
17. Pirog EC, Kleter B, Olgac S, Bobkiewicz P, Lindeman J, Quint WG Et Al. Prevalence of human papillomavirus DNA in different histological of cervical adenomacarcinoma. Am J Pathol 2000; 157: 1055-62.
-
18. Zambrano A, Kalantari M, Simoneau A, Jensen JL, Villarreal LP. Detection of human polyomaviruses and papillomaviruses in reveals the prostate as a hábitat for multiple viral infections. Prostate 2002; 53: 263-76.
-
19. Lorenzato FR, Singer A, Ho L, Santos LC, Batista R de L, Lubambo TM et al. Human papillomavirus detection for cervical cáncer prevention polymerase chain reaction in self-collected samples. Am J Obstet Gynecol 2002; 186: 962-8.
-
20. Shibata D, Martin WJ, Arnheim N. Analysis of DNA sequences in forty years old paraffin-embedded sections: a bridge between molecular biology and classical. Cancer Res 1988; 48: 4564-6.
-
21. Peng HQ, Roth P, Caussy D, Rawls W. Comparison of the cytobrush and cotton swabs in sampling for filter in siitu hybridization detection of human 16 and 18 DNA. Acta Cytol 1988; 32: 311-3.
-
22. Redondo Horcajo AM, Guerra Merino A, Pinedo Garrido, García Aranda R. Prevention of cérvix cáncer. Comparison of the simple quality obtained using cotton swab or cervical brush. Aten Primaria 2000; 38-41.
-
23. Wright DK MM. Sample preparation from paraffin-embedded tissues. In: Innis M GD, Sninsky J, White T, editor. PCR protocols. A guide to methods and applications. San Diego, CA: Editorial Academic Press, Inc; 1990:p153-8.
-
24. De Guglielmo CZ, Ávila HM, Correnti M, Veitía MD, Cavazza M. Evaluación mediante RCP de la infección por el virus de papiloma humano en muestras de pacientes con diagnóstico clínico o citológico. Rev Obstet Ginecol Venez 2008; 68(4): 240-247.
-
25. González Losa MR, Manzano-Cabrera L,, Rueda Gordillo F, Hernández Solis SE, Puerto Solis M. Low prevalence of high risk human papillomavirus in normal oral mucosa by hibrid capture 2. Brazilian Journal of Microbioloy 2008; 39: 32-34.
-
26. Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho GY, Klein RS, et al. PCR detection of human papillomavirus comparison between MY09/11 and GP5+/6+ primers systems. J Clin Microbiol 1997; 35: 1304-10.
-
27. Cox T, Cuzick J. HPV DNA testing in cervical cáncer screening: From evidence to policies. Gynecol Oncol2006; 103: 8-11.
-
28. Castle P, Schiffmann M, Gravitt P, Fishman S, et al. Comparisons of HPV DNA detection by MY09/11 PCR methods. J Med Virol 2002; 68: 417-423.
-
29. Aedo S, Melo A, García P, Guzmán P, Capurro I, Roa JC. Detección y tipificación de Virus Papiloma Humano en lesiones preneoplásicas del cuello uterino mediante PCRRFLP. Rev Med Chile 2007; 135: 167-173.
-
30. Graterol I, Finol H, Correnti M. Virus del papiloma humano en lesiones intraepiteliales escamosas (LIE) de cuello uterino. Tipificación y ultraestructura. Rev Soc Ven Microbiol 2006; 26: 89-94.
-
31. Kay P, Meehan K, Williamson AL. The use of nested polymerase chain reaction and restriction fragment lenght polymorphism for the detection and typing of mucosal human papillomaviruses in samples containing low copy numbers of viral DNA. Journal of virological methods 2002; 105: 159-170.
-
32. Kornegay JR, Shepard AP, Hankins C, Lapointe N, Richardson H, Cou tlée F, et Al. Non-isotopic detection of human papillomavirus DNA in clinical specimens using a consensus PCR and a generic probe mix in an enzyme. linked immunosorbent assay format. J Clin Microbiol 2001; 39: 3530-6.
1Odontóloga Magíster. Hospital Pediátrico Dr. Avelino Castelán. dramyriammedina@yahoo.com.ar
2Médico cirujano Magíster. Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste. drmarcelomedina@yahoo.com.ar
3Bioquímico Doctor..Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste. lamerino@gigared.com
Fechas de Publicación
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Publicación en esta colección
31 Oct 2013 -
Fecha del número
Dic 2012
Histórico
-
Recibido
13 Ene 2012 -
Acepto
10 Jul 2012
