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Revisión bibliográfica • Rev. costarric. cienc. méd 23 (3-4) • Dic 2002 •

Open-access Diferenciación de Entamoeba histolytica / entamoeba dispar y  los nuevos hallazgos en la patogénesis de la amibiasis intestinal

AutoríaSCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

    Resúmenes

    La introducción de nuevas metodología moleculares ha permitido la diferenciación de Entamoeba histomica de la ameba comensal Entamoeba dispar, morfológicamente idéntica a E. histolytica. Entre los mecanismos de patogenicidad en Entamoeba histolytica se encuentra la presencia de la lecitina de galactosa-galactosamina en la superficie de los trofozoito, responsables de la adhesión a las células intestinales. También se han identificado polipéptidos solubles denominados ameboporos, los que se insertan en la membrana de fa célula blanco e inducen la lisis celular. Además se han caracterizado proteasas de cisteína, capaces de degradar distintos componentes de la matriz extracelular. Las proteasas de cisteína están también involucradas en la evasión de la respuesta inmune por cuanto degradan inmunoglobulinas IgA e IgG, y las anafilotoxinas C3a y C5a. En E. dispar se ha demostrado la presencia de ameboporos y proteasas de cisteína en menor concentración y con menor actividad biológica lo que se cree tiene un impacto en la carencia de patogenicidad de esta especie. Se revisan los nuevos hallazgos en cuanto la epidemiología en distintos países del mundo, utilizando las técnicas moleculares de diferenciación para E. histolytica. En Costa Rica la seroprevalencia por E. histolytica en pacientes con heces positivas por quistes de E. histolyticale / E. dispar fue de 7,3%, por lo que se considera que la mayoría de los pacientes en cuyo examen al fresco se observan quistes se trata verdaderamente de E. dispar, por cuanto la presencia de anticuerpos se utiliza para diferenciar una infección por E. histolytica de una causada por E. Dispar. El referencia al diagnóstico el hallazgo de trofozoitos con eritrocitos fagocitados en heces frescas o biopsias se correlaciona con la presencia de E. histolytica. Por el contrario los quistes de ambos protozoarios son indistinguibles. En la actualidad se dispone de variadas técnicas inmunológicas, algunos comercialmente disponibles, para la detección de antígenos en heces y anticuerpos en suero, para ambos casos la técnica más utilizada es el ELISA.

    patogénesis; epidemiología; diagnóstico diferencial

    The introduction of molecular techniques allowed the differentiation of Entamoeba histomica from E. dispar, a comensal ameba morphologically indistinguisable from E. histolytica. Pathogenic mechanisms of E. histolytica inciudes the presence of a galactosa binding lectin that attachs trophozoites to intestinal epithelial cells. Also pore-forming peptides termed amebopores have been demonstrated, this peptides oligomerize after insertion in the cell membrane and form waterfilled channels through which ions and other molecules can pass, causing cell lysis. Cysteine proteasas have also been characterized as a viruience factor responsable of the degradation of the extracellular matrix and the evasion of the immune response by degradation of IgA, disruption of IgG, and degradation of anaphylotoxins C3a and C5a. The new epidemiological findings around the worid by the use of molecular technics are also discussed. In Costa Rica seroprevalence of 7,3% in E.histoyica / E.dispar cysts positive patients is taken an indication that the majority of the infections are caused by E. dispar. Antibody are present only in E. histoyica infection. As far as diagnosis, the finding of trofozoites with enguifed eritrocytes in fresh fecal samples or biopses correlates with E. histoyica. On the other hand, cysts of both protozoa are indistinguisable. Several immunological technics are available for the determination of antigen in stool samples or antibodies in sera.

    pathogenesis; epidemiology; diferencial diagnosis

    Diferenciación de Entamoeba histolytica / entamoeba dispary los nuevos hallazgos en la patogénesis de la amibiasis intestinalL Reyes 1,  R León  2

     

    Resumen

    La introducción de nuevas metodología moleculares ha permitido la diferenciación deEntamoeba histomica de la ameba comensalEntamoeba dispar,morfológicamente idéntica aE.histolytica. Entre los mecanismos de patogenicidad en Entamoeba histolyticase encuentra la presencia de la lecitina de galactosa-galactosamina en la superficie de los trofozoito, responsables de la adhesión a las células intestinales. También se han identificado polipéptidos solubles denominados ameboporos, los que se insertan en la membrana de fa célula blanco e inducen la lisis celular. Además se han caracterizado proteasas de cisteína, capaces de degradar distintos componentes de la matriz extracelular. Las proteasas de cisteína están también involucradas en la evasión de la respuesta inmune por cuanto degradan inmunoglobulinas IgA e IgG, y las anafilotoxinas C3a y C5a. EnE. dispar se ha demostrado la presencia de ameboporos y proteasas de cisteína en menor concentración y con menor actividad biológica lo que se cree tiene un impacto en la carencia de patogenicidad de esta especie.

    Se revisan los nuevos hallazgos en cuanto la epidemiología en distintos países del mundo, utilizando las técnicas moleculares de diferenciación para E. histolytica.En Costa Rica la seroprevalencia por E. histolytica enpacientes con heces positivas por quistes deE. histolyticale / E. dispar fue de 7,3%, por lo que se considera que la mayoría de los pacientes en cuyo examen al fresco se observan quistes se trata verdaderamente de E. dispar,por cuanto la presencia de anticuerpos se utiliza para diferenciar una infección porE. histolytica de una causada por E.Dispar.

    El referencia al diagnóstico el hallazgo de trofozoitos con eritrocitos fagocitados en heces frescas o biopsias se correlaciona con la presencia de E.histolytica. Por el contrario los quistes de ambos protozoarios son indistinguibles. En la actualidad se dispone de variadas técnicas inmunológicas, algunos comercialmente disponibles, para la detección de antígenos en heces y anticuerpos en suero, para ambos casos la técnica más utilizada es el ELISA.

    Palabras clave

    Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, patogénesis, epidemiología, diagnóstico diferencial.

    Abstract

    The introduction of molecular techniques allowed the differentiation of Entamoeba histomica from E. dispar, a comensal ameba morphologically indistinguisable from E. histolytica. Pathogenic mechanisms of E. histolytica inciudes the presence of a galactosa binding lectin that attachs trophozoites to intestinal epithelial cells. Also pore-forming peptides termed amebopores have been demonstrated, this peptides oligomerize after insertion in the cell membrane and form waterfilled channels through which ions and other molecules can pass, causing cell lysis. Cysteine proteasas have also been characterized as a viruience factor responsable of the degradation of the extracellular matrix and the evasion of the immune response by degradation of IgA, disruption of IgG, and degradation of anaphylotoxins C3a and C5a.

    The new epidemiological findings around the worid by the use of molecular technics are also discussed. In Costa Rica seroprevalence of 7,3%in E.histoyica / E.dispar cysts positive patients is taken an indication that the majority of the infections are caused by E. dispar. Antibody are present only in E. histoyica infection.

    As far as diagnosis, the finding of trofozoites with enguifed eritrocytes in fresh fecal samples or biopses correlates withE. histoyica. On the other hand, cysts of both protozoa are indistinguisable. Several immunological technics are available for the determination of antigen in stool samples or antibodies in sera.

    Key words

    Entamoeba histolytica,Entamoeba dispar,pathogenesis, epidemiology, diferencial diagnosis.


    Introducción

    La aplicación de las técnicas de biología molecular ha permitido la diferenciación deEntamoeba histolytica, agente etiológico de la amibiasis intestinal, de una ameba comensal, morfológicamente idéntica denominadaEntamoeba dispar.

    En el año 1875 el médico ruso Fedor Lösch describe el caso de un granjero que había sido admitido a su clínica en St. Petersburgo. Este joven presentaba un cuadro de disenteria crónica y al observar las heces Lösch encontró gran cantidad de amebas a las que denominó con el nombre deAmoebacoliy cuya descripción concordaba con la morfología típica deEntamoeba histomica (1). Sin embargo, Lösch no consideró que las amebas fueran causantes de la diarrea, sino que ayudaban a mantener el proceso inflamatorio (1).

    Durante los años siguientes se presentó una serie de discrepancias entre los distintos investigadores, principalmente en cuanto a los aspectos taxonómicos, lo cual se refleja en la gran cantidad de nombres que este parásito recibió(Amoeba coli, Amoeba dysenteriae, etc) (2). El 1903 el zoólogo alemán Fritz Schaudinn, diferencióEntamoeba coli ameba comensal del intestino, de la ameba patógena capaz de destruir tejido, característica por lo que la llamó por primera vezEntamoeba histolytica (3). Schaudin murió en el año 1906 a la edad de 35 años de complicaciones secundarias a una amibiasis adquirida de manera experimental (3).

    En el año 1925 Emil Brumpt parasitólogo francés describió una especie deEntamoeba similar morfológicamente Entamoeba histolytica, con cuatro núcleos en su forma quística, y la denomina Entamoeba dispar, considerándola no patógena. Sus conclusiones se fundamentaron en tres argumentos: primero, el seguimiento por un período de ocho años de individuos infectados que nunca desarrollaron síntomas; segundo la infección de gatos, un método muy sensible para la producción experimental de amibiasis intestinal, que conE. dispar nunca llevó a la producción de síntomas y por último estudios epidemiológicos que demostraban altas tasas de infección por E.histomica en países en los que no se reportaban casos de amibiasis. Brumpt concluye con estos datos que las infecciones en países de zonas templadas eran debidas a una especie distinta aunque morfológicamente idéntica aE. histolyticay la denominó E. dispar ( 4,5). Todos estos argumentos fueron rechazados por la comunidad científica internacional principalmente por considerarse en ese momento que el concepto de especie representaba una idea morfológica y no debería basarse en aspectos patológicos (6).

    La resurrección de E. disparcomo una especie diferente a E. histolyticaocurrió muy lentamente. En 1978 Sargeunt y Williams utilizando los patrones de migración electroforética de tres isoenzimas (glucosa fosfato isomerasa, fosfoglucomutasa y malato oxidoreductasa) lograron establecer cuatro diferentes zimodemas, uno de los cuales es relacionado con la forma invasora y los otros con la forma no invasora o comensal (7). Con la inclusión de la hexokinasa y su respectivo patrón electroforético, se demostró que aislamientos derivados de casos sintomáticos presentan una banda de hexokinasa de rápida migración (banda á) y por el contrario, los aislamientos de pacientes asintomáticos bandas de lenta migración (8,9). Finalmente, se establece la presencia de veintiún zimodemas, de los cuales nueve corresponden a zimodemas no patogénicos, actualmente identificados paraE. dispar y los restantes doce a zimodemas patogénicos que corresponden aE. histolytica (10).

    En los años posteriores además de las diferencias en los patrones de migración electroforética, se desarrollaron anticuerpos monocionales contra varios antígenos que permiten diferenciar las cepas invasoras de las no invasoras. Dentro de estos se encuentran: la lectina de adherencia Gal/GalNac (GIAP) (11), un antígeno de superficie de 96 kDa (12,13), un antígeno proteínico interno de 81-84 kDa (14), una proteína hidrofílica de membrana de 29 kDA/30 kDa (15,16), así como el antígeno aislado de los gránulos electrodensos (EDG) producidos al interactuar trofozoitos del parásito con colágeno "in vitro" (17).

    Con el advenimiento de mejores técnicas para el análisis del ADN, los procesos de hibridación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se establecieron diferencias no sólo a nivel bioquímico y antigénico sino también desde el punto de vista genético principalmente en secuencias altamente repetitivas de¡ ADN circular extracromosomal (18,19), así como diferencias en genes codificantes para la actina (20), la cisteina proteinasa (21), la superóxido dismutasa (22).

    De acuerdo a esta evidencia inmunológica, bioquímica y genética, en 1993 Diamond y Clark (23) confirman la validez deEntamoeba dispar Brumpt, 1925 como una especie diferente a laE. histolytica, Schaudinn 1903. La Organización Mundial de la Salud en 1997 reconoce que la diferenciación ha sido universalmente aceptada y recomienda el reportar el hallazgo de quistes y trofozoitos de la forma comensal comoE. histoyica / E. dispar (24,25)

    La presente revisión trata de difundir los hallazgos más relevantes para la diferenciación, epidemiología y diagnóstico de la amibiasis intestinal.


    Patogénesis

    La patología en amibiasis se inicia por la adherencia deE. histoyica a las células intestinales. Dentro de los principales factores de adherencia encontramos la lectina denominada lectina gal/N-acetil galactosamina (GIAP), que se une a residuos de galactosa-galactosamina en las glicoproteínas de la célula blanco (26,27). Este receptor es un heterodímero formado por una cadena pesada y una liviana, siendo codificado por cinco genes (28,29). La cadena pesada es además, una proteína integral de membrana que une 8 y 9 y bloquea la formación de complejo de membrana en la cascada del complemento (30). Se ha descrito además una molécula de 37kDa que puede servir como receptor de la fibronectina (31,32).

    El principal factor de virulencia presente enE. histolytica es su capacidad de citotoxicidad, proceso que está mediado por una serie de factores y sustancias producidas por la ameba dentro de las cuales destacan los ameboporos y las proteasas de cisteína (33).

    La familia de los ameboporos comprende tres isomorf os, el ameboporo A, B y C, que se encuentran en una proporción aproximadamente de 35:10:1 respectivamente y presentan un 35-57% de identidad en sus secuencias de aminoácidos. (34,35) Los ameboporos son polipéptidos solubles que se insertan en la membrana de la célula blanco por la unión con fosfolípidos aniónicos a bajo pH, oligomerizan, proceso mediado por la interacción péptido-péptido, difunden en la membrana y forman un canal a través de¡ cual se produce la salida de iones y otras moléculas pequeñas. En consecuencia el medio interno celular cambia y esto resulta en muerte por lisis ( 35). Se ha demostrado que los ameboporos presentan homología con el polipéptido de las células NK y de los linfocitos citotóxicos de cerdos, con la saponina y con el surfactante de la proteína B ( 34,36), todas estas sustancias producen un efecto lítico similar a los ameboporos.

    Se ha postulado que los trofozoitos deE. histolytica son resistente a la actividad del ameboporo por cuanto su membrana celular posee fosfolípidos neutros que impiden la unión de los polipéptidos (37,38). La principal función de los ameboporos es la eliminación de las bacterias fagocitadas principal fuente de alimento de los trofozoitos (39,40).

    En E. dispar se ha demostrado la presencia de ameboporo A y B, en menor concentración y con menor actividad biológica lo que se cree tiene un impacto en la carencia de patogenicidad de esta especie (41).

    Por su parte, las proteasas de cisteína son las enzimas proteolíticas encontradas en mayor concentración en los lisados deEntamoeba histolytica (42) Un total de ocho tipos diferentes han sido descritos, de los cuales EHCP 1, EHCP 2, y EhCP 3, con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa, comprenden un 90% del total de la actividad de proteasa hallada en el protozoario (43). Estas enzimas han sido asociadas a la degradación de la matriz extracelular (fibronectina, laminina, colágeno) (26,31) y a la evasión de la respuesta inmune al digerir la IgA, (44 ) , IgG (45 ) y la inactivación de las anafilotoxinas (C3a y C5a) (46,47 ). Por su parte, en aislamientos de E. dispar estas proteasas se han encontrado en menores concentraciones lo cual se ha relacionado con su falta de virulencia (21,43). 

    Epidemiología

    E. histolyticacausa a nivel mundial de 50100 millones de casos de colitis invasiva o abscesos hepáticos (25,48) y aproximadamente 70 000 muertes al año, colocándose en el segundo lugar dentro de las parasitosis que causan más muertes a nivel mundial, superada únicamente por la malaria con un estimado para el año 2 000 de entre 1,1 millones de muertes. (49) En cuanto a la incidencia para el año de 1997, la amibiasis ocupa un tercer puesto antecedido por malaria y tricomoniasis (50 ).

    Áreas altamente endémicas porE. histolytica incluyen la India, el oeste y surdeafrica, así como ciertas regiones de Sur y Centro América en donde más del 50% de las poblaciones de alto riesgo pueden estar infectadas (25). Uno de los países latinoamericanos más afectados es México en donde, de acuerdo a un estudio del año 1 994, la prevalencia de anticuerpos contra E.histolytica en una muestra de 67 668 personas y representativa de la población general, fue de 8,4% (51). Por otro lado en Nicaragua se ha informado una seropositividad en personas asintomáticas excretoras de quistes de aproximadamente de 7,3% con el uso de un ELISA para la detección de IgG, encontrándose además un pico de prevalencia en el grupo de edad de los 5 a 16 años (52). Estudios en la región norte de las Filipinas, utilizando PCR, muestran una prevalencia del 0,96% de infección porE. histolyticay del 7,16 % por E. dispar en la población general (53). En Bangladesh se ha informado una prevalencia de 4,2% porE. histomica y de 6,5% por E. disparen niños del área urbana con diarrea y una prevalencia de 1 % por E. histolytica y 7% por E. dispar en niños asintomáticos del área rural (54). En Brasil, Braga et al (55) reporta un 24,7% de positividad en 335 individuos con un promedio de edad de 14 años (Cuadro l).

    Prevalencia en Costa Rica

    En nuestro país Reyeset al informan una prevalencia de 16% de E.histolytica / E. dispar en niños de guarderías del Cantón Central de San José utilizando examen directo, concentración y tinción con hematoxilina férrica ( 56). Otro estudio realizado por Morales et al (57) encuentran una prevalencia del 2,9% en el año de 1989 y del 1,08% en 1994, en ambos casos en la comunidad de Torremolinos en Desamparados. En la provincia de Limón se ha demostrado una prevalencia porE. histolytica / E. dispar en la zona central y alrededores es del 7,5 % (58). En pacientes HIV seropositivos se ha demostrado 9,3% de positividad porE. histolytica / E. dispar en heces por método directo (59).

    En referencia a la prevalencia de anticuerpos contraE. histolytica, León y Reyes (60) realizaron un estudio en 41 pacientes positivos por quistes deE.histolytica / E disparen heces. Se demostró la presencia de anticuerpos utilizando la técnica de ELISA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en 3 de las 41 muestras de suero analizadas (7,3%). La mayoría de los pacientes fueron asintomático (n 29), dentro de los cuales se encontró un único caso serológicamente positivo (3,4%). De los pacientes con algún tipo de sintomatología asociada con amibiasis (n 12) se demostró seropositividad en 2 casos (1 6%) (59). En conclusión, este estudio demostró que la gran mayoría de los pacientes del área metropolitana de San José, en cuyo examen al fresco se observan quistes de E. histolytica / E. dispar, setratan de E. dispar, esto por cuanto la presencia de anticuerpos se utiliza para diferenciar una infección por E. histoyica de una provocada por E. dispar (59).

    Si estimáramos en promedio en nuestro país una prevalencia de E.histolytica / E. dispar de aproximadamente 7% y si consideramos que un 7% de estos pacientes a su vez presentan anticuerpos, se podría extrapolar una prevalencia deE. histolytica en la población general cercana al 0,5%. Estas estimaciones parecen corresponder con el bajo número de casos clínicos observados en nuestro país.

    Los distintos indicadores de salud, por ejemplo el nivel de cobertura por agua potable, el porcentaje de hogares con servicio sanitario, la disponibilidad de atención médica, pueden explicar las diferencias en la prevalencia de amibiasis entre nuestros país y otros países subdesarrollados (24,25).


    Diagnóstico

    El diagnóstico parasitológico de la amibiasis intestinal está basado en la demostración de trofozoitos deE. histomica en las heces por medio del análisis directo en solución salina, lugol o tinción (hematoxilina férrica o tinción tricrómica), o su demostración en biopsias de la mucosa intestinal o hepáticas. El examen microscópico de una única muestra de heces lleva a una sensibilidad del 50 al 70%, por lo que se requiere de al menos el análisis de tres muestras diferentes para lograr una sensibilidad del 90% (10).La eficacia de muchas de estas técnicas diagnosticas, básicamente la observación directa de las heces así como las tinciones, está determinada por la habilidad y experiencia del microbiólogo para detectar y diferenciar a los trofozoitos deE. histolytica deotras amebas comensales, de leucocitos, etc. Además como ya se indicó la observación directa de los quistes no permite diferenciar entre E.histolytica y E. dispar.El hallazgo de trofozoitos con eritrocitos fagocitados en heces frescas u otros especimenes y trofozoitos en biopsia tisular están en ambos casos fuertemente correlacionados con la presencia deE. histolytica y enfermedad invasiva (4,10).

    Acuña-Soto et al (61) informan que no hay diferencias estadísticas significativas en cuanto al diámetro de los quistes entre las dos especies, demostrando un promedio paraE. histomica de 12,27 ± 1,29 u y de 1 1,63 ± 0,81 para E. dispar, por lo anterior es imposible hacer la diferenciación con la simple observación de quistes al microscopio.

    Por estas razones en los últimos años se han realizado considerables esfuerzos en desarrollar técnicas inmunológicas para una fácil detección deE. histolytica.De esta forma existen en la actualidad métodos inmunológicos, algunos comercialmente disponibles, que pueden detectar tanto antígenos en heces como anticuerpos en suero y para ambos casos la técnica más utilizada es el ELISA (62).

    Entre estas tenemos: el empleo de antígenos solubles de una cepa patógena (63,64), principalmente la denominada HM1:IMSS, los cuales se obtienen a partir de un cultivo de la ameba y un proceso de sonicación. Con este tipo de antígeno podría esperarse que la especificidad nos sea la apropiada, sin embargo partiendo deshecho de que únicamente la infección porE. histolytica va a generar una respuesta inmune humoral detectable (10), este aparente inconveniente no representa un gran problema.

    Otros métodos más específicos que utilizan la lectina denominada GIAP. Esta lectina de 260 kDa presenta dos subunidades: una pesada de 170 kDa unida por puentes disulfuro con otra subunidad liviana de 35 kDa. La subunidad de 170 kDa es antigénicamente conservada y además es inmunogénica, por el contrario la de 35 kDa no desarrolla una respuesta inmune (62). Por lo anterior, el antígeno de 179 kDa ha sido utilizado tanto para la detección de anticuerpos (64,65), como para el desarrollo de anticuerpos monocionales que permiten su identificación directamente en las heces (66-68). Se ha desarrollado anticuerpos monoclonales contra esta subunidad y establecido la presencia de al menos 6 epitopos importantes como posibles herramientas para la diferenciación deE. Histolytica / E. dispar. Dos de estos anticuerpos monoclonales reconocen dos epitopos presentes en ambas especies y los cuatro restantes reconocen epitopos que se encuentran sólo en la especie patógena (62,68).

    El empleo de antígenos recombinantes (69,70-72) como es el caso de la subunidad de 170 kDa (69,71,72) o del antígenos denominado proteína deE. histomicarica en residuos de serina (SREHP) (69), ofrecen una serie de ventajas: pueden ser producidos en grandes cantidades con relativa facilidad, se evita la necesidad de mantener cultivos deE. histolytica yademás el uso de un antígeno recombinante puede ayudar al desarrollo de un ensayo bien estandarizado (69,71). Otro posible beneficio es la aparente capacidad que tienen los ELISA basados en este tipo de antígenos, para diferenciar un cuadro agudo de crónicos (69,70). Esto sería muy útil principalmente en zonas altamente endémicas en donde el número de individuos seropositivos por infección anterior es muy elevado (69). Estos estudios han establecido que pacientes con absceso hepático amibiano se tornan seronegativos a estos antígenos a partir de los 120 días posteriores a la aparición de los síntomas ( 69).

    Recientemente se han desarrollado anticuerpos monocionales que reconocen específicamente los quiste en muestras no fijadas (73) y trofozoitos en muestras preservadas (74). Estos hallazgos podría constituir una importante herramienta ya que eventualmente acoplados a un ELISA, permitirían diferenciar directamente en las heces los quistes y/o trofozoitos deE. histomica de los de E. dispar. En la actualidad la diferenciación de los quistes de E. histolytica y E. dispar directamente de las heces y sin recurrir al cultivo, únicamente se puede realizar empleando PCR (16,51,52).Las pruebas serológicas son de gran importancia principalmente en áreas no endémicas ya que en estos sitios un 90% de los individuos con amibiasis invasiva poseen anticuerpos anti-E. histolytica (25). En estas áreas la serología es una prueba diagnóstico sensible debido a la predominancia de individuos seronegativos. Otra técnica que se ha venido desarrollando desde los inicios de los años 90, es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual ha demostrado ser muy eficaz para la diferenciación de ambas especies pero cuyo empleo se haya limitado a estudios epidemiológicos o experimentales pero no a nivel diagnóstico rutinario (18,19,53).

    Referencia

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    1Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales

    2Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica.

    Fechas de Publicación

    • Publicación en esta colección
      17 Mar 2004
    • Fecha del número
      Dic 2002
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