INTRODUCCIÓN

En la actualidad, no se conoce de algún método eficiente que por sí solo disminuya significativamente la enfermedad de la marchitez causada por Fusariumspp. en diferentes cultivos. Se han realizado grandes esfuerzos por combatirla y en estos momentos varios países aplican un manejo integrado, en el que se incluyen la poda fitosanitaria, fertilización al suelo, reguladores de crecimiento y aspersiones con fungicidas (Jiménez y Sanabria 1997a y b,Agrios 2005,Caravaca 2008). Estos últimos son utilizados con mayor frecuencia; sin embargo, suuso indiscriminado provoca problemas de contaminación ambiental y en general, desequilibrio ecológico (De la Cruz 2004).

El uso de Trichodermacomo agente de biocontrol representa una alternativa viable, por ser eficaz, fácil de producir a gran escala, la mayoría son especies cosmopolitas y presentan gran capacidad de parasitar; además compiten por nutrientes o producen compuestos que resultan antagónicos para una gran variedad de hongos fitopatógenos tales como los géneros Rhizoctoniaspp., Fusarium spp., Pythiumspp., entre otros (Montealegre et al. 2005,Chérif y Benhamou 1990,Córdoba 2003,Hibaret al. 2005, 2006,Gupta et al. 2014).

Los eventos que conllevan al micoparasitismo son complejos y tienen lugar de manera ordenada. En primer lugar,Trichoderma localiza al patógeno y comienza a crecer por tropismo hacia él (Lu et al. 2004). Esta detección a distancia se debe al menos parcialmente, a la expresión secuencial de enzimas que degradan la pared celular de los hongos, en inglés conocido como Cel Wall DegradingEnzymes (CWDEs). Aunque las diferentes cepas de Trichoderma pueden seguir distintos patrones de inducción de CWDEs, parece seguro que una exoquitinasa extracelular, que se produce de forma constitutiva en pequeñas cantidades, podría estar implicada en este proceso. Esta exoquitinasa provoca la liberación de algunos oligómeros de la pared del hongo. Esos compuestos son los que inducen la expresión de endoquitinasas tóxicas (Brunner et al. 2003,Harman 2006) que al ser liberadas por Trichoderma, se difunden y comienzan el ataque al hongo patógeno antes de que se haya producido el contacto físico (Zeilingeret al. 1999,Viterbo et al. 2002b).

Es importante mencionar que el mecanismo micoparasítico de Trichoderma integra la acción de diversasCWDEs entre las cuales se encuentran quitinasas, β-1,3-glucanasas, β-1,6-glucanasas y proteasas (Eladet al. 1982, Papavizas 1985, Chet et al. 2002, Sanz et al. 2004).

Debido a que la quitina y el β-1,3-glucano son los principales componentes estructurales de la pared celular de hongos, se ha propuesto que las enzimas claves en este proceso son las quitinasas y las β-1,3-glucanasas (Eladet al. 1982,Papavizas 1985,De la Cruz et al. 1993). Por otra parte, se tienen en cuenta otras enzimas que hidrolizan otros componentes minoritarios de las paredes fúngicas (proteínas, β-1,6-glucanos, α-1,3-glucanos) (Viterbo et al. 2002a,Sanz et al. 2005,Suárez et al. 2008,Olmedo y Casa 2014).

Actualmente, en Costa Rica, no se dispone de información certerarespecto a las diferentes cepas de Trichodermaspp. aisladas de los mismos sitios de cultivo, o si las importadas de otros cultivoso países, presentan la misma eficiencia y especificidad en el combate de las especies del género Fusarium. Además, aún se tienen interrogantes acerca de la existencia de alguna relación específica antagónica entre Trichodermaspp. y Fusariumspp., o si todas las cepas tienen potencial de antibiosis,por lo que es requerido detectar su presencia para conocer la diversidad de cepas nativas, para evaluarlas como agentes potenciales de combate biológico y comprobar su especificidad con respecto al patógeno a combatir (Papavizas1985,Nelson 1991). Por lo anterior, se propuso como objetivo de este análisis,determinar la efectividad de cepas nativas e importadas deTrichodermaspp. en el combate deFusarium spp. a nivel de laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación. El estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología Agrícola, del Centro de Investigaciones Agronómicas de la Universidad de Costa Rica.

Aislamiento e identificación de las cepas de Trichodermaspp. y del patógeno Fusariumspp. Se emplearon productos comerciales preparados con diferentes cepas de Trichodermaspp.provenientes de Estados Unidos (THU-01) y Colombia (THC-02); así como 2 cepas nativas de Costa Rica pertenecientes a la Colección de Microorganismos Benéficos del Área de Biocontrol, del Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de Investigaciones Agronómicas de la Universidad de Costa Rica (THM-03, San Carlos y THM-04, Cartago).

Los aislamientos de Trichodermaspp. a partir de los productos comerciales se realizaron mediante el método de diluciones seriadas en caja Petri, para lo cual se tomó una muestra de 1 gr del producto y se diluyó en 10 mL (proporción 1/10 p/v) de agua destilada estéril hasta obtener diluciones de 10^-2 y 10^-3. De la última dilución, se extrajo una alícuota de 0,1 mL y se distribuyó homogéneamente sobre una caja Petri, que contenía medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA). Se incubaron a 25±1ºC por 5-6 días en oscuridad y luego 4 días con luz día en una incubadora Digisystem DK-500. Se utilizaron 10 cajas Petri por cada producto comercial. Para la identificación se utilizó el método descrito por Gilchrist et al. (2005), y las claves de identificación propuestas por Samuelset al. (2013) y Ellis (2006).

Los aislamientos de Fusariumspp., se realizaron a partir de muestras de plantas enfermas de tomate que presentaban marchitez, necrosamiento basal del tallo y de las axilas de las ramas laterales inferiores. Las plantas se lavaron con agua común para eliminar el exceso de suelo presente en el tallo y raíz.De los tejidos se hicieron disecciones de 0,5 cm de la zona de avance de la enfermedad, cada trozo se desinfectó con hipoclorito de sodio al 2,5% por 2 min y, posteriormente, se realizó 4 enjuagues con agua destilada estéril. Luego, cada trozo se fraccionó en secciones de aproximadamente 0,25 cm y se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agra (PDA). Los aislamientos obtenidos se purificaron mediante la técnica de punta de hifa descrita por Chairmanet al. (1978), la cual consiste en seleccionar la punta de una hifa solitaria, cortarla y transferirla a una caja Petri. Se usó medio de cultivo Komoda (Komoda 1975) y se dejó incubar por 2 o 3 días.

Las diferentes cepas obtenidas se identificaron morfológicamente con base en el protocolo del FusariumResearch Center de la Universidad de Pennsylvania, desarrollado por Burgeset al. (1994) y Gilchrist et al. (2005), y las claves taxonómicas de Booth (1971), Arikanet al. (2001) y Seifert (1996).

Caracterización molecular de las cepas de Trichodermaspp.y Fusarium spp. El ensayo se llevó a cabo en el Laboratorio de Técnicas Moleculares del CIPROC de la Facultad de Ciencias Agroalimentarias de la Universidad de Costa Rica. Se realizó la extracción del ADN de las diferentes cepas de Trichodermaspp. y de los aislamientos de F.Oxysporum; para esto, se separó un disco 5 cm de diámetro de un cultivo de 3-5 días de crecimiento de los hongos. Luego los discos de micelio se secaron con toallas de papel absorbente. Posteriormente, el disco se colocó en un tubo Eppendorf de 1,5 mL para la extracción de ADN. La extracción de ADN genómico se realizó utilizando el kit de aislamiento de ADN Genómico de Puregene^TM.

Posteriormente, para Trichodermaspp., se llevó a cabo la amplificación por PCR de un fragmento de 0,9 kb del extremo 5' del factor de elongación -1α (TEF) del gen (eEF1a1) que contiene 3 intrones que fueron amplificados utilizando el par de imprimador tef71f (CAAAATGGGTAAGGAGGA(G/C)AAGAC) y el tef997R(CAGTACCGGC(A/G) GC(A/G)AT(A/G)AT(G/C)AG) (Shoukouhi y Bissett 2008).Luego se hizo una electroforesis para corroborar el resultado de la amplificación y, por último, el producto de PCR obtenido se limpió empleando el kit de purificación para PCR (QIAGEN), se envió a secuenciar a la empresa Macrogen Inc., en Seúl, Corea.

Para el caso de los aislamientos de Fusariumspp., se efectuó el protocolo para el PCR para amplificar la región del gen TEF, utilizando el imprimador de inicio ef1 (5'-TGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3) y el imprimador de reversa ef2 (5'GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3') (O’Donnell et al. 1998,Geiser et al. 2004); a los productos amplificados del hongo se les efectuó una electroforesis en gel de agarosa. Finalmente, se realizó la secuenciación por la empresa Macrogen Inc., en Seúl, Corea.

Las secuencias obtenidas para cada imprimador fueron analizadas con el programa BioeditSequenceAlignment Editor version 7.0.5.3 (Hall 1999) y se obtuvo la secuencia consenso. Las secuencias se compararon con las secuencias publicadas en la base de datos del Banco de Genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica en USA (NCBI), mediante la opción BLASTnsearch (Altschulet al. 1997).

Se alinearon con el programa Clustal W (Thompson et al. 1994) la secuencia de ADN de la región del factor de elongación -1α (TEF) del gen (eEF1a1) de las cepas de Trichodermaspp.e incluidas las secuencias de aislamientos de especies de Trichoderma del Banco de Genes. El alineamiento fue corregido manualmente en el programa BioEdit. El análisis filogenético de las secuencias se hizo con el programa MEGA 6 (Tamura et al. 2013), según el criterio de Máxima Verosimilitud, el modelo Kimura 2-parameter y un análisis de 2000 réplicas de Bootstrap. Se incluyó la secuencia de Trichodermaaggressivum CBS 100.525 (AF534614) como grupo externo (raíz) en el análisis filogenético de las especies del complejo de Trichodermaharzianum. Las secuencias de la región del factor de elongación -1α (TEF) utilizadas fueron las mismas que empleóChaverri et al. (2015) en su análisis filogenético del Complejo de T. harzianum.

Pruebas de micoparasitismo a nivel de laboratorio. Se utilizó la técnica del papel celofán modificada (Dennis y Webster 1971), para seleccionar aquellas cepas de Trichodermaspp. que presentaron capacidad antagónica in vitro, al inhibir o retardar el crecimiento del micelio de Fusariumspp. Se cortaron tiras de 2,0 cm de ancho por 8,5 cm de largo de papel celofán, las cuales se esterilizaron antes de colocarlas bajo condiciones asépticas dentro de la caja Petri, sobre el medio de cultivo PDA.Posteriormente, en un extremo de la caja de Petri, se colocó un disco de agar de 4 mm de diámetro con micelio de Fusarium spp. de 8 días de edad y se dejó desarrollar durante 3 días por su crecimiento lento. Luego, en el extremo opuesto otro disco de 4 mm con micelio de Trichodermaspp.(nativos o comerciales) de la misma edad, a una distancia aproximada de 5 cm entre ellos (Howell 2003). También se cultivó, por separado cada antagonista y patógeno; se colocó un disco de agar de 4 mm de diámetro de micelio en el centro de la caja Petri, que correspondieron a los testigos y se incubaron bajo las condiciones antes descritas.

Se midió cada 24 h el crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos, hasta observar el traslape de hifas de ambos hongos en el papel celofán. En este momento se retiró el papel y se observó con microscopio (Biológico Binocular, Modelo Xsz 206 B) con aumento de 40x, para determinar si se presentaba hiperparasitismo.

Para evaluar la capacidad antagónica o antagonismo de aislamientos nativos o foráneos de Trichodermaspp.,se utilizó la técnica de Cherif y Benhamou (1990), y cada tratamiento se depositó en un extremo de cajas Petri con PDA, un disco de 5 mm de diámetro con micelio activo de colonias fungosas de 8 días de edad de Fusariumspp. y se dejaron desarrollar durante 3 días por su crecimiento lento. Posteriormente, en el otro extremo de la caja se depositaron discos de 5 mm deTrichodermaspp. Luego se incubaron a 25±1ºC por 5-6 días en oscuridad y luego, 4 días con luz de día en una incubadora Digisystem DK-500. Se midió cada 24 h el crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos.

Se comprobó de distintas formas: a) el grado de micoparasitismo, mediante la escala propuesta por Ezziyyaniet al. (2004) (Tabla 1).

Además, se evaluó: b) la competencia por nutrientes y espacio, la cual se obtuvo con los radios de crecimiento de cada patógeno y antagonista en cultivo dual, junto con sus respectivos testigos, utilizando un calibrador “Pie de rey”, y c) por el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR) con la fórmula utilizada por Ezziyyaniet al. (2004).

PICR = (R1 - R2)/R1 x 100

R1 = radio mayor (radio patógeno testigo).

R2 = radio menor (radio del patógeno en enfrentamiento con el antagonista).

El análisis estadístico que se utilizó fue un análisis de varianza (Anova) y prueba de comparación de medias de Tukey (p<0,05) con el programa estadístico Infostat versión 6.12, bajo un diseño experimental completamente al azar con 3 repeticiones que constaban de un plato Petri, como unidad experimental, y 4 réplicas biológicas por cepa de Trichodermaspp. Se midieron las siguientes variables: radio de crecimiento del antagonista (RCA), radio de crecimiento del patógeno (RCP), micoparasitismo (MICMO) y PICR.

RESULTADOS

Aislamiento e identificación de las cepas de Trichodermaspp. y del patógeno Fusarium spp. Las cepas THU-01 (Estados Unidos) y la cepa nativa THM-04 se identificaron dentro del complejo de Hypocrealixii/ Trichodermaharzianum(Figura 1), sin embargo, nuevos estudios filogenéticos identifican estas cepas como Trichodermaguizhouense(Chaverri et al. 2015) (Figura 2).Las mismas crecieron muy rápido en medio de cultivo PDA y mostraron un aspecto polvoso. Al inicio, las colonias presentaron una coloración blanco amarillento que luego se tornó verde. Con microscopio, se observaron fialides terminales en un verticilo o solitarias de forma ampuliformes, por lo general, fuertemente constreñidos por debajo de la punta y más largas que las fialidessubterminales con un conidio sucesivo en la extremidad y conidias de forma globosa a subglobosa de color verde olivo, características que concuerdan con las descritas por Chaverri et al. (2015) para T. guizhouense.

Árbol construido con el programa MEGA 6 software, método Máxima Verosimilitud (ML), modelo Kimura 2-parameter y 2000 réplicas de Bootstrap. Valores de Bootstrap se indican en los nodos.

Árbol construido con el programa MEGA 6 software, método Máxima Verosimilitud (ML), modelo Kimura 2-parameter y 2000 réplicas de Bootstrap.

Se incluyó de raíz a T. aggressivum.

Valores de Bootstrap se indican en los nodos.

Al colocar las cepas THC-02 (Colombia) y la cepa nativa THM-03 en medio de cultivo PDA, crecieron formaron anillos concéntricos, los primeros en crearse fueron de color verde oscuro, mientras que en los márgenes el micelio fue blanco y no se observó pigmentación amarilla. Con microscopio se observaron fialidescon aspecto de candelabro producidos en las puntas de las hifas, ligeramente más grandes en el medio y levemente constreñida en la base, con conidiassubglobosas a elipsoidales de color verde oscuro, con clamidosporas normalmente abundantes y subglobosas. De acuerdo con lo descrito por Samuelset al. (2010, 2013), las cepas THC-02 y THM-03 pertenecen a Trichodermaasperellum.

A partir de plantas enfermas de tomate, se aislaron 2 cepas de Fusarium sp., las cuales se caracterizaron por las colonias que crecieron en el medio de cultivo, y que expusieron un micelio aéreo blanco, que posteriormente adquirió, en uno de los aislamientos, una coloración púrpura (F1), mientras que el otro aislamiento presentó esporodoquios de coloración anaranjado medio (F2). Ambas cepas presentaron conidióforos monofialides cortos, simples, laterales en el micelio aéreo, más tarde en forma de racimos densamente ramificados. Los macroconidios eran fusiformes, principalmente, de 3 septos y abundantes microconidios elipsoidales, no septados en su mayoría. Las clamidosporas eran terminales o intercalares e hialinas. Las características identificadas concuerdan con las descritas por Burgeset al. (1994) y Gilchrist et al. (2005) y las claves taxonómicas de Booth (1971), Arikanet al. (2001), y Seifert (1996) con F. oxysporum.

En lo siguiente, fue seleccionada la cepa F1 de F. oxysporumpara llevar a cabo los demás ensayos, debido a que la cepa F2 presentó problemas de crecimiento en los diferentes medios de cultivo utilizados.

Caracterización molecular de las cepas de Trichodermaspp.y Fusarium spp. Las secuencias de la región del factor de elongación -1α (TEF) obtenidas de las diferentes cepas aisladas de Trichoderma,de los productos nativos e importados, se alinearon con secuencias encontradas en el Banco de Genes (Gen Bank) (Tabla 2);se identificaron THU-1 y THM-4 con un 97% de similitud con T. harzianum/ H. lixii.mientras que en el caso de THC-2 tuvo un 99% de similitud con T. asperellum y el mismo porcentaje obtuvo THM-3 con T. asperelloides.

Al realizar el análisis filogenético basado en los fragmentos de tef (Figura 1), se demostró que las cepas THU-01 y THM-04, con un valor de Boostrap de 100,eran idénticas,por lo que formaron un grupo monofilético dentro del complejo de T. harzianum/ H. lixii.

Por otra parte, en el árbol de la Figura 1se muestra también que existió una relación entre las especies de T. asperellum y T. asperelloides con un Boostrap de 87, sin embargo, con un Boostrap de 99 se encontró la cepa THC-02 dentro del grupo de T. Asperellum, y con un Boostrap del 100 se identificó el grupo de T. Asperelloides, así como algunos aislamientos de T. asperellum que no se han reclasificado.

Complementariamente, se realizó otro análisis filogenético para determinar la correcta clasificación de las cepas de Trichodermaque en el primer análisis fueron agrupados dentro del complejo de T. harzianum/ H. lixii, y se obtuvo que corresponden a la nueva especie identificada como Trichodermaguizhouense(Figura 2).

Al comparar las cepas aisladas de Fusariumspp., las secuencias obtenidas de la región del factor de elongación -1α (TEF) con otras en el Banco de Genes, se encontró una similitud del 99% para la cepa F1;mientras que, la cepa F2 solo obtuvo una similitud del 98%, las cuales se identificaron como F. oxysporumcon número de AccesiónKF574861 y KJ648634, respectivamente.

Pruebas de micoparasitismoa nivel de laboratorio. Al realizarse la confrontación in vitro de las diferentes cepas aisladas de productos comerciales importados (THU-01 y THC-02) y nativas (THM-03 y THM-04) de Trichodermaspp. frente al patógeno Fusarium oxysporum, estas presentaron radios de crecimiento del antagonista (RCA) superiores a los radios de crecimiento del patógeno (RCP). Se observó que el primer contacto entre hifas del antagonista y el patógeno fue de 3 a 4 días en la mayoría de las cepas a excepción de la cepa THU-01 que fue entre 5 a 8 días. Sin embargo, con el papel celofán, solo con la cepa THU-01 se logró observar el traslape de hifas de ambos hongos, ya que para las demás cepas de Trichodermaspp., en la mayoría de los casos, el antagonista no permitió que el patógeno creciera lo suficiente para alcanzar la mitad de la caja Petri, donde se encontraba el papel celofán.

Los mayores radios de crecimiento de las cepas de Trichoderma fueron THC-02 (Colombia), y THM-03 (nativa) con 39,3, y 41,2 mm respectivamente (Figura 3A). Cabe destacar que las cepas del antagonista llegaron a tener un radio de crecimiento muy cercano al de los respectivos tratamientos testigos, de manera que a los 8 días del ensayo, en todos los casos, lograron cubrir totalmente la superficie de la caja Petri con 42,75 mm (100%).

Por otra parte, los radios de crecimiento del patógeno (Figura 3B) en casi todos los tratamientos estuvieron por debajo del testigo que alcanzó un crecimiento de 25,05 mm; no obstante, el tratamiento que contenía la cepa THU-01 (proveniente de Estados Unidos) tuvo poco efecto sobre el desarrollo del patógeno con un RCP de 23,95 mm cercano al testigo (Figura 3B) y el menor RCA (Figura 3A).

En laFigura 4se observan los resultados de la prueba de micoparasitismo, en las cepas THC-02 y THM-04 que lograron alcanzar el grado 4, mientras que THM-03 obtuvo un 3,6, que logró una invasión total de la superficie de la colonia del patógeno y esporular sobre ella, mientras que la THU-01 solo obtuvo 1 grado, que invadió un 1/4 de la superficie de la colonia de F. oxysporum.

Letras diferentes indican diferencias significativas para Tukey p=0,05.

Las barras verticales representan el error estándar.

Al determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR), la mayoría de los tratamientos lograron superar el 50% de inhibición del crecimiento radial del patógeno F. oxysporum(Figura 5). Se encontraron diferencias significativas entre cepas (p≤0,0001), donde las más efectivas fueron THM-03, THC-02, THM-04 con 67%, 63%, 59% de inhibición respectivamente, mientras que con el THU-01 solo alcanzó un 44%.

Las barras verticales representan el error estándar. THU-01 y THM-04: T. guizhouense; THC-02: T. asperellum y THM-03: T. asperelloides.

DISCUSIÓN

Trichoderma es un grupo monofilético (Kullniget al. 2002) con teleomorfos en el género Hypocrea o relacionados con Hypocreales. Estudios sobre la conexión entre teleomorfos-anamorfos exponen características morfológicas traslapadas entre especies en los anamorfos del género Trichoderma (Chaverri y Samuels 2003). En consecuencia, las diferencias morfológicas no son indicadores fiables del grado de divergencia genética entre las especies y observaciones morfológicas, solas no son suficientes para la identificación precisa de las especies.

En estainvestigación se identificaron las diferentes cepas aisladas de productos comerciales importados, así como, 2 cepas aisladas de cultivos en Costa Rica, por lo tanto la cepa THU-1 (Estados Unidos) y la cepa nativa, proveniente de Cartago, THM-04 se identificaron como Trichodermaguizhouense, la cual es una especie del complejo Trichodermaharzianum, que fue descrita por Chaverri et al. (2015). Además, es importante tomar en cuenta que el producto utilizado de Estados Unidos (THU-1) dice contener T. harzianum, sin embargo, según este análisis, la especie no correspondía, lo cual se comparó con el estudio realizado por Chaverri et al. (2015), quienes al revisar la taxonomía de las especies del complejo de Trichodermaharzianumajustado al factor de elongación 1-α (TEF1) y al analizar cepas de productos comerciales utilizados para biocontrol, determinaron que la mayoría de estos productos presentan una errónea identificación de la especie de Trichoderma, ya que productos como el Promot dice contener T. harzianum cuando en realidad es T. guizhouense u otros productos que utilizan la cepa T22 de “T. harzianum” y en realidad es T. afroharzianum.

Además, de las características moleculares evaluadas para derterminar especies de Trichoderma, es importante el enfoque ecológico y distribución geográfica de especies, ya que se considera que Trichodermaharzianum se encuentra en Europa y Norte Américaen hábitats en su mayoría de suelo, también del compost de setas y en ocasiones endótifo en tallos y posiblemente es fungícola. En el caso deT. guizhouense es posiblemente cosmopolita y se encuentra en África (Camerún, Ghana), Europa (Croacia, Grecia, Italia y España) y Asia (Indonesia, Japón). El hábitat es similar a T. harzianum(Chaverri et al. 2015).

En el caso de las cepas THC-02 (Colombia) y la cepa nativa THM-03 (San Carlos) se identificaron morfológicamente como Trichodermaasperellum(Figura 1), sin embargo, al realizar los análisis moleculares de las secuencias del factor de elongación 1-α (TEF1) se determinó la cepa nativa THM-03 como T. asperelloides(Figura 2). En un estudio realizado por Samuelset al. (2010) nombran a esta nueva especie, segregándola a partir de T. asperellum, y aclaran que esta nueva especie no puede distinguirse por su fenotipo, biología o biogeografía y queademás, las características morfologícasson muy similares entre las 2 especies, pero es más común encontrar a T. asperellum. Es por ello que todavía se encuentren aislamientos de T. asperellum que no se hayan re-identificado como T. asperelloides como se observa en el árbol de las relaciones filogenéticas o que no existe todavía una buena separación de los linajes, ya que posiblemente T. asperelloides derivó de T. asperellum. La diversidad sugiere que T. asperellumse originó por recombinación, mientras que T. asperelloidesparece ser clonal (Mukherjeeet al. 2013).

En cuanto a las pruebas de micoparasitismo in vitro, se pudo observar que variaron los tiempos para el contacto entre hifas de las diferentes cepas de Trichodermaspp. y las de F. oxysporum; aunque al patógeno se le dio 3 días de ventaja, porque su crecimientofue más lento. Al comparar con otros estudios, estos resultados son muy similares a los encontrados por Michel (2001), quien encontró valores al primer contacto entre cepas nativas de Trichodermaspp. y F. oxysporum (Fo) de 3 a 6 días y con F. subglutinans (Fs) de 3 a 10; mientras que, Solano (2004) de 3 a 4 días con F. oxysporum y de 2 a 3 con F. subglutinans. De la misma manera Michel et al. (2005b) mencionan entre 5 y 7 días para el contacto de T. harzianumcontra F. oxysporumf. sp. lycopersici. Según Michel et al. (2009), indican que entre menor sean los días al contacto, es mayor la agresividad que existe por parte del hongo antagonista y menor la resistencia del fitopatógeno. La colonización del área,al competir por espacio y nutrientes, es una manera de ejercer biocontrol, ya que se reduce o se detiene por completo el desarrollo del micelio del otro hongo (Dennis y Webster 1971)

En cuanto a los radios de crecimiento de las colonias, tanto del patógeno como de las cepas del antagonista, se lograron encontrar diferencias significativas (p≤0,0001) entre las cepas de Trichodermaspp. nativas y las importadas de otros países frente al patógeno F. oxysporum.El mayor antagonismo corresponde a las cepas THC-02 (T. asperellum) y THM-03 (T. asperelloides) y la cepa de T. guizhouense(THM-04) (Figura 3 A y B).Los resultados son similares a los presentados en un estudio de confrontación in vitro de cepas de T. harzianumvs. F. solani realizado por Suárez et al. (2008). Este mayor crecimiento por parte de las cepas de Trichodermapodría deberse a que presentaron una mayor tasa de incorporación de nutrientes, metabolismo y un crecimiento superior a F. oxysporum, debido a que se utilizaron distintos mecanismos como secreción de enzimas hidrolíticas, entre ellas celulasas, quitinasas, glucanasas, xilasas y muchas veces las proteasas, las cuales pueden estar implicadas en los mecanismos de biocontrol, lo que permite al antagonista aprovechar mejor los nutrientes del medio y privar al patógeno de utilizar los recursos disponibles (Zeilinger y Oman 2007,Vinaleet al. 2008,Rojanet al. 2010).

De acuerdo con la clasificación del micoparasitismo, mediante la escala (Figura 4), se demuestra que a nivel de laboratorio tanto Trichodermaasperellum, T. asperelloides como T. guizhouense pueden ejercer su antagonismo sobreFusarium oxysporum, pero existen diferencias entre cepas de la misma especie T. guizhouense, como es el caso de THU-01 (grado 1) y THM-04 (grado 4). Si se compara con otros estudios que emplearon una escala de clasificación de antagonismo similar a la de este estudio de Bell et al. (1982), donde 1=Trichodermasobrecrece completamente al patógeno y cubre totalmente la superficie del medio, 2= Trichodermasobrecrece las 2 terceras partes de la superficie del medio, 3= Trichoderma,y el patógeno colonizan cada uno, aproximadamente la mitad de la superficie y ningún organismo parece dominar al otro, 4= el patógeno coloniza las 2 terceras partes de la superficie del medio y parece resistir a la invasión por Trichoderma,y 5= el patógeno sobrecrece completamente a Trichodermay ocupa la superficie total del medio. En el caso de F. solani y F. oxysporum, Michelet al. (2005a) encontraron diferente antagonismo (1, 2 y 3),por lo que se obtuvo menor número de cepas con antagonismo 1 con Fo. En otro ensayo se clasificó el antagonismo de 20 cepas de Trichoderma contra el mismo patógeno y todas resultaron ser clase 1 (Michel 2005b), lo cual corresponde al grado 4 de este ensayo según la escala de Ezziyyaniet al. (2004). Al evaluar esas mismas cepas de Trichodermacontra SclerotiumrolfsiiSacc., solo 3 fueron clase 1 y 2, y en las demás cepas el patógeno fue más agresivo.

Se debe tener presente que el complejo proceso de micoparasitismose compuso de muchos eventos que surgieron desde el reconocimiento del hospedero, el ataque y la subsecuente penetración y muerte. Durante el proceso, Trichoderma secretó enzimas que degradaron la pared celular del otro hongo. Además, por la secreción de exoenzimas hidrolíticas disminuyó el crecimiento y la actividad del patógeno (Vinaleet al. 2008,Brunner et al. 2003,Harman 2006, 2008).

Una vez que los hongos estuvieron en contacto, Trichoderma puede enrollarse alrededor de las hifas del hongo patógeno y formar estructuras especializadas de tipo apresorio, las cuales pueden penetrar en el interior de su adversario. La unión parece estar mediada por la interacción entre carbohidratos de la pared celular de Trichodermay lectinas del patógeno (Inbar y Chet 1996,Rocha-Ramírez et al. 2002). Una vez en contacto, Trichoderma produce varias CWDEs (Cel Wall DegradingEnzymes) y antibióticos, como los peptaiboles (Schirmböcket al. 1994; Degenkolbet al. 2003), que generarían agujeros en la pared celular. Finalmente, Trichoderma digirió el contenido intracelular del hongo, proceso que fue acompañado de algunos cambios morfológicos como vacuolización, pérdida de citoplasma y desintegración de las hifas del hospedante (Benhamou y Chet 1996). En algunos casos, también se observó la esporulación de Trichodermatras la digestión del otro hongo (Eladet al. 1984).

Al determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR), la mayoría de los tratamientos lograron superar el 50% de inhibición del crecimiento radial del patógeno F. oxysporum(Figura 5). Aunque Trichodermaguizhouensefue menos efectiva para combatir al patógeno, la cepa nativa (THM-04) presentó más eficacia que la importada. SegúnPloetz (2004),la especificidad de las especies de Trichoderma, en la eficacia del combate de Fusarium oxysporum, son contradictorios, y la mayoría se refieren a la eficiencia de los ensayos in vitro o invernadero bajo condiciones controladas y por lo tanto, dichos resultados no se pueden generalizar a todas las especies y cepas aisladas deTrichoderma. Además, el antagonismo de las cepas de Trichodermaspp. pueden deberse a que liberan metabolitos secundarios, volátiles y no volátiles, que producen un efecto de antibiosis (Cardoza et al. 2005,Webster y Weber 2007,Shoreshet al. 2010).

En conclusión, se encontraron diferencias morfológicas, pero no genéticas entre las mismas especies nativas de Costa Rica y las importadas en productos comerciales para el hongo Trichodermaspp; por lo tanto, es necesario realizar otros estudios moleculares que permitan comprender las posibles diferencias genéticas intra-específicas para este género.

En las pruebas in vitro se presentaron diferencias en la capacidad antagónica de las diferentes especies de Trichoderma frente al patógeno Fusarium oxysporum, ya que las cepas de T. asperellum, T. asperelloidesy la cepa nativa de T. guizhouense mostraron ser más agresivas en el combate del patógeno, independiente de su procedencia, por lo que se podría ampliar el estudio con más aislamientos.

Referencias bibliográficas

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