Introducción

El tabaco (Nicotianatabacum L.) es una de las plantas comerciales no comestibles que ocupa mayor área de siembra en la agricultura mundial y es uno de los pocos cultivos agroindustriales que se comercializa completamente en forma de hojas (Calero-Hurtado et al. 2019). En Cuba la producción de N. tabacumse realiza principalmente al sol y empalado, del cual se obtiene el puro cubano que posee una excelente calidad y un alto costo en el mercado internacional (Toledo et al. 2016).

En Cuba se plantan anualmente aproximadamente 15 868 ha, con un rendimiento promedio de 3,89 t.ha^-1, mientras que, en la provincia Granma solamente se obtienen 1,0 t.ha^-1. Este bajo rendimiento puede ser atribuido a las afectaciones del fitopatógeno Fusariumspp. (Barceló y Mustelier 2019). Esta especie fúngica se conoce mundialmente por causar la enfermedad denominada marchitez vascular y es capaz de ocasionar la pudrición basal del tallo en tabaco. Tanto en semilleros como en campo abierto, causa daños en el sistema radical, que afecta directamente los procesos de absorción de agua y nutrientes e influye negativamente sobre el rendimiento y calidad del cultivo (Retana et al. 2018).

La identificación de Fusarium spp., es compleja y requiere de mucho tiempo, recursos humanos y materiales. La caracterización cultural posibilita el desarrollo de microorganismos en un medio de cultivo in vitro y con ello, los aspectos cualitativos relacionados con la forma, tamaño, textura, coloración, esporulación, entre otros, mientras que la morfométrica permite dilucidar las estructuras de interés taxonómico para determinar elementos relacionados con su talla. Por tanto, la combinación de estas formas de caracterización propone una efectiva identificación de especies fúngicas con claves ilustradas, sin recurrir a las técnicas moleculares que requieren mayor cantidad de recursos materiales y financieros, inaccesibles para muchos países pobres y en vías de desarrollo (Leslie y Summerell 2008, Castro López et al. 2018).

Conocer las principales características de las especies de Fusarium que afectan a N. tabacum en agroecosistemas tabacaleros de la provincia Granma, resultará de gran interés científico para los programas de mejora de esta planta y para el establecimiento de alternativas de manejo del fitopatógeno en etapa de semillero y en campo. Según lo anterior, el objetivo de esta investigación fue caracterizar cultural-morfométricamente las especies de Fusarium asociadas a N. tabacum cultivado en la provincia Granma, Cuba.

Materiales y métodos

Muestreo. Se muestrearon áreas especializadas en la producción de N. tabacum a campo abierto en la provincia Granma (Tabla 1). Las plantaciones tenían edades entre 20-40 días después del trasplante. Los campos se muestrearon en forma diagonal, se colectaron plantas enteras con daños evidentes de pudrición basal del tallo, con síntomas de clorosis y marchitez del follaje (González et al. 2005). Las muestras obtenidas se introdujeron en bolsas de nylon y se trasladaron inmediatamente al Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal (CEBVEG), Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Granma, Cuba, para su procesamiento y caracterización.

Procesamiento en laboratorio. Cada muestra se cortó en fragmentos de 1 cm y se desinfestó con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1,0% durante 3 minutos; luego se lavaron con detergente comercial y finalmente se enjuagaron 3 veces con agua destilada esterilizada. Seguidamente se establecieron cámaras húmedas en placas Petri (Ø = 90 mm) con papel de filtro esterilizado y humedecido. Se incubaron a 28±2ºC y se observaron diariamente hasta la aparición de estructuras fúngicas durante 168 h. Luego se verificó la presencia de Fusariumspp., al microscopio óptico (Novel, modelo N200M, China) y con ayuda de un asa de siembra se recogieron fragmentos de micelio que fueron sembrados en placas Petri (Ø = 90 mm) en medio PDA: 39 g.L^-1BioCen, esterilizado a 121ºC durante 15 min y pH = 6) más cloranfenicol (0,01 g.L^-1), incubándose a 28±2ºC en oscuridad hasta lograr el crecimiento de las colonias.

Las colonias crecidas en las placas se cubrieron con 10 mL de agua destilada estéril y se homogenizaron en un agitador Vortex por 30 s. Con un asa bacteriológica desinfectada, se tomó una asada de la suspensión y se depositó en el centro de las placas (Ø = 90mm) que contenía 5 mL de medio de cultivo Agar agua (2%) para dispersarla con una varilla L de vidrio. Todas las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 28±2ºC y oscuridad durante 24 h. Luego, bajo microscopio óptico (20x) se detectaron y señalaron conidios solitarios germinados. Seguidamente con una aguja de siembra flameada se transfirió el fragmento de agar que contenía el conidio germinado a una placa Petri con medio de cultivo PDA más cloranfenicol. Las placas se sellaron con parafilm e incubaron a 28±2ºC durante 7 días. Una vez que se lograron los cultivos puros monospóricos se conservaron a 4ºC. Posteriormente, se comprobaron los postulados de Koch (Duarte et al. 2016).

Caracterización cultural-morfométrica de aislados de Fusariumspp. Se realizó sobre la base de caracteres cualitativos y cuantitativos, expresados por los aislados sobre los medios de cultivo PDA, Carnation Leafpiece Agar (CLA se elaboró al verter en cada placa 15 ml de Agar agua estéril; seguidamente se depositaron 7 fragmentos de hojas de clavel (Dianthuscaryophyllus L) de 3-5 mm² previamente esterilizadas y pH ajustado a 6), SpeziellerNährstoffarmer Agar (SNA: 1g de KH₂PO_4, 1g de KNO₃, 0,5 de MgSO₄.7H₂O, 0,5 de KCl, 0,2 de glucosa, 0,2 de sacarosa, 20g de Agar, esterilizado a 121ºC durante 15 min y pH ajustado a 6) y agar nutriente (AN: 28 g.L^-1BioCen, esterilizado a 121ºC durante 15 min y pH ajustado a 6). Se emplearon placas Petri (Ø = 90 mm) que contenían 20 mL de cada medio de cultivo independientemente. Las mismas se inocularon, central e individualmente, con un disco de micelio (Ø = 5 mm) de cada aislado, proveniente de la periferia de colonias crecidas sobre PDA durante 7 días. Las placas, 4 por aislado (réplicas), se sellaron con parafilme incubaron (28±2ºC y oscuridad). Las evaluaciones se realizaron cada 24 h hasta las 168 h. La coloración de la colonia en el anverso y reverso se determinó por observación visual y se documentó mediante fotografías con una cámara digital. También se describió la textura superficial, forma de los bordes, presencia de anillos en el anverso, formación de sectores y concentración de esporas. Se midió el diámetro de la colonia con una métrica graduada. A partir del diámetro de la colonia se calculó la velocidad media de crecimiento al séptimo día de incubación, mediante el empleo de la siguiente fórmula:

V crec=DC⁄T

Donde

V crec = velocidad de crecimiento del aislado (mm.h^-1)

DC = diámetro de las colonias (mm)

T = tiempo transcurrido (h)

El conteo de las esporas se realizó a los 7 días del crecimiento de las colonias de cada aislado y en cada medio. A las placas con los aislados crecidos se le adicionó 10 mI de agua destilada estéril y se homogeneizaron con una varilla L de vidrio. La suspensión de esporas se colectó en un tubo de ensayo con una capacidad de 20 mI. A partir de estas, se prepararon diluciones hasta 10^-2. Se usó un tubo capilar para extraer pequeñas porciones de la dilución y se depositó una gota en una cámara de Neubauer para determinar la concentración de los macroconidios con ayuda de un microscopio Novel a 40x.

Aspectos taxonómicos evaluados. Se preparó un microcultivo en porta objeto cavado con medio CLA, donde se depositó un fragmento de 3-5 mm² de hoja de clavel esterilizado y sobre este se añadió una gota de medio agar agua (AA: 20 g.L^-1BioCen, esterilizado a 121ºC durante 15 min y pH ajustado a 6). Una vez solidificado el medio se inoculó cada aislado con ayuda de una aguja de siembra. Seguidamente se estableció el microcultivo en una cámara húmeda. Posteriormente, a las 24 h se visualizaron al microscopio óptico (40x) los macroconidios, células conidiógenas y microconidios (presencia y disposición). Se hicieron preparaciones microscópicas permanentes para observar la forma, el tamaño de los macroconidios y los septos, y se determinó la presencia y disposición de las clamidosporas. Se observó la pigmentación en todos los medios. En PDA de determinó la forma y la velocidad de crecimiento de las colonias, la formación de esporodoquios y el número de septos en los macroconidios; mientras que, en SNA se observó la presencia de clamidosporas y la forma de los micro y macroconidios. La caracterización hasta nivel de especie se efectuó con la clave taxonómica ilustrada (Leslie y Summerell 2008).

Diseño y procesamiento estadístico. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con arreglo bifactorial: Factor A (4 medios de cultivos) y factor B (9 aislados de Fusariumspp.) para un total de 36 interacciones o tratamientos y 4 réplicas. Se usó un ANOVA bifactorial y la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (p≤0,05). Previamente al ANOVA los valores de concentración de macroconidios fueron transformados por LOG (x+1), procesado con el programa estadístico InfoStat 2008.

Resultados

Caracterización cultural de los aislados de Fusarium spp. Al analizar la pigmentación de los aislados de Fusariumspp., en el anverso de las placas en medio PDA se observó que variaron entre blanco y blanco cremoso, excepto el aislado F que presentó tonalidad violeta. En el reverso la coloración observada fue color crema y blanco. Todos los aislados presentaron colonias con bordes redondeados y regulares, con una textura afelpada y algodonosa. La formación de anillos se evidenció en los aislados C y G, mientras, que en el aislado H además de estos caracteres se notaron sectores (Figura 1).

Finalmente, de esta parte, sobre la base de los resultados alcanzados se consideró al medio PDA como el más idóneo para la caracterización cultural de especies de Fusarium procedentes de N. tabacum, debido a una mayor variabilidad cultural y pigmentación.

Caracterización morfométrica de los aislados de Fusarium spp. Al analizar la velocidad media de crecimiento se constataron diferencias (Tukey p ≤ 0,05) entre aislados en los diferentes medios de cultivo evaluados. La mayor velocidad media se alcanzó en los medios CLA y PDA, mientras que la menor se obtuvo en los medios AN y SNA. Los aislados A, B, C y E mostraron una mayor velocidad media en PDA y CLA, respectivamente, así como el aislado F en CLA, mientras que registraron la menor velocidad media D, G y H en PDA y H e I en CLA (Tabla 2).

Al analizar la concentración de macroconidios se observó diferencias significativas (Tukey p ≤ 0,05) entre aislados en los diferentes medios de cultivo evaluados. La mayor concentración de macroconidios por aislado se cuantificó en los medios PDA y SNA, y la menor se obtuvo en CLA y AN. Los aislados A, B, C, D, E, F, G e I mostraron mayor esporulación en PDA, mientras que en SNA fueron B, C, D, E, F y H (Tabla 3).

El análisis cultural y morfométrico posibilitó la determinación de 5 especies de F. oxysporum (A, B, C, D, H) y 4 de F. phyllophylum (I, E, F, G) (Tabla 4). Todos los aislados de F. oxysporum presentaron esporodoquios, sin embargo, los aislados de F. phyllophylum no mostraron esta estructura, a excepción del aislado G. Los macroconidiosF. oxysporum mostraron una longitud que osciló entre 8,17-33,35 µm, mientras que el ancho fluctuó entre 1,45-6,30 µm, con formas semicurva y recta a ligeramente semicurva. Se observaron células apicales con forma curvada y ligeramente curvada, mientras que las células basales se mostraban ligeramente alargadas y alargadas en forma de pie, los macroconidios de esta especie presentaron 3 septos. Los macroconidios de F. phyllophylum registraron un largo que osciló entre 6,68-20,10 µm, mientras que, el ancho fluctuó entre 1,42-4,67 µm con formas semicurva y recta a ligeramente semicurva, se observaron células apicales redondeadas, las células basales mostraron forma ligeramente redondeada, los macroconidios presentaron de 1-3 septos (Figura 5).

Los microconidios de F. oxysporum y F. phyllophylum no presentaron septos. Estas estructuras en la especie F. oxysporum se mostraron de forma arriñonada, menos el aislado C que manifestó una apariencia oval, mientras que, en F. phyllophylum se exhibieron fusiformemente (Tabla 5). Se observó la presencia de células conidiógenas monofiálides en todos los aislados de ambas especies. Las clamidosporas se observaron individualmente en los aislados de F. oxysporum. Ambas especies presentaron un micelio aéreo en falsas cabezas.

Los resultados obtenidos en esta investigación poseen importancia para el programa nacional de selección y mejoramiento de variedades de N. tabacum tolerantes a Fusariumspp., muestran una alta especificación de F. oxysporum y F. phyllophylum como especies fitopatógenas asociadas a N. tabacum y evidencian los riesgos potenciales de proliferación del fitopatógeno en agroecosistemas tabacaleros.

Discusión

En el medio PDA no se observó gran variabilidad cultural, lo cual pudo ser atribuido a la poca biodiversidad de especies presentes. Al respecto Tapia y Amaro (2014) y Rentería-Martínez et al. (2019) expresaron que aislados de Fusariumspp., crecidos en PDA mostraron una amplia diversidad de coloraciones, entre ellas café, rojo, violeta, naranja, gris y blanco. Las personas autoras constatan que dicha variabilidad se debió a la alta biodiversidad de especies presentes y observadas durante la investigación. Se conoce que la pigmentación del micelio puede deberse a la disponibilidad de nutrientes y al pH del medio de cultivo. Por su parte, Quilambaqui (2005) y Duarte et al. (2016) informaron que especies de Fusarium mostraron coloraciones del micelio violeta, púrpura, violáceo, amarillento, blanquecino, rojo ladrillo y rosa salmón en medio PDA a un pH de 6, tal variabilidad no fue observada en el presente estudio.

Los medios SNA, CLA y AN poseen baja concentración de nutrientes y de péptidos, lo cual pudo incidir sobre la pigmentación y el desarrollo de los aislados. Al respecto, Hernández Amasifuenet al. (2019) y Almaraz-Sánchez et al. (2018) informaron que medios pobres en nutrientes influyeron sobre la coloración y la formación de estructuras fúngicas de Fusariumspp., lo expuesto coincidió con el resultado obtenido en la presente investigación, donde se puso de manifiesto una escaza coloración del micelio fúngico.

La máxima velocidad media de crecimiento observada, pone de manifiesto una asimilación diferencial de los nutrientes por los aislados en cada medio de cultivo y se relaciona con la capacidad de colonización de este hongo en suelos y sustratos. Los resultados coinciden con lo informado por Dueñas et al. (2007), quienes expresaron que los aislados de Fusariumspp., obtenidos de Cicerarietinum mostraron un rápido crecimiento en medio PDA. Más recientemente Duarte et al. (2016) expusieron que aislados de Fusariumspp. procedentes de C. arietinum alcanzaron la mayor velocidad de crecimiento 0,63 mm.h^-1 en medio CzapekDox. En la presente investigación la mayor velocidad de crecimiento registrada por los aislados de Fusarium pudiera relacionarse con una rápida colonización de estos aislados en el suelo y sobre su hospedante vegetal.

La concentración de macroconidios constatada en esta investigación es mayor a los resultados obtenidos por Duarte et al. (2016) en especies de F. oxysporum aisladas de C. arietinum, los cuales registraron una esporulación entre 0,06-0,32x10⁶ macroconidios.mm^-2, mientras que en F. phyllophylum obtuvieron 0,34x10⁶ macroconidios.mm^-2 en medio PDA. En otros estudios, Lazarottoet al. (2014) y Almaraz-Sánchez et al. (2018) evidenciaron que en aislados de Fusariumspp., se alcanzó un rango de esporulación entre 1,20-2,94x10⁶macroconidios.mL^-1, dichos resultados fueron similares a los obtenidos en el presente estudio.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se consideró que la variabilidad de los macroconidios en cuanto a su morfología, características de las células apicales y basales, su tamaño y la formación de septos, los reafirma como la principal estructura para la identificación de especies de Fusarium. Al respecto, Leyva-Mir et al. (2017) informaron que en una caracterización de especies de Fusarium obtenidas del trigo se desarrollaron macroconidios con una talla de 24-33 × 2-2,3 μm con 3 septos, célula apical curvada y basal ligeramente alargada, con micelio de coloración púrpura-violeta; mientras que, en aislados que obtuvieron una coloración blanca-amarillenta registraron un tamaño de 22-48 x 2,5-4,2 μm. Por su parte, Duarte et al. (2016) registraron un tamaño de macroconidios de 11,04-39,22 μm de largo y 1,01-4,14 μm de ancho en F. oxysporum, lo cual coincidió con las características morfométricas de los aislados analizados en esta investigación.

Se considera que la variabilidad de los microconidios en cuanto a su forma, tamaño y presencia de septos posee una relación con el medio de cultivo donde crece y con la especie en cuestión. Al respecto, Leslie y Summerell (2008), Cardona-Piedrahíta y Castaño-Zapata (2019) informaron que los aislados de F. oxysporum mostraron microconidios en forma oval y arriñonados, células conidiógenas monofiálides, microconidios en falsas cabezas y clamidosporas individualmente, lo cual coincidió con lo observado en el presente estudio. En este mismo sentido, Duarte et al. (2016) informaron que los microconidios de F. phyllophylum procedentes de C. arietinummostraron de 0-1 septos y una apariencia fusiforme, similar a lo descrito en esta investigación.

Conclusiones

Se caracterizan eficazmente por el método combinado cultural-morfométrico 9 aislados de Fusariumspp., (5 de F. oxysporum y 4 de F. phyllophylum). La caracterización cultural evidenció una mayor variabilidad de la pigmentación en el medio PDA en comparación con los restantes medios, mientras que, la morfométrica demostró una diferenciación inter e intraespecífica en la formación de estructuras microscópicas, lo que verificó una talla de macroconidios que oscila entre 8,17-33,35x1,45-6,30 µm en F. oxysporum y de 6,68-20,10x1,42-4,67 µm en F. phyllophylum. Lo expuesto, evidencia la selectividad de estas dos especies por N. tabacum y señala la necesidad de monitorear la fitopatogenecidad de este patógeno con el propósito de establecer su correspondiente manejo.

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