INTRODUCCIÓN

El fruto de la pitahaya (Hylocereus spp.) es un recurso que se cultiva en zonas tropicales y subtropicales relativamente intensiva. La produc- ción se comercializa sobre todo en los mercados regionales de los países productores, pero tam- bién se coloca con éxito en el mercado internacio- nal de frutos exóticos, como fruto fresco, aunque también en forma de pulpa congelada o productos procesados (Vargas et al. 2005).

En Europa y Estados Unidos se ha incre- mentado el interés en este fruto por su apariencia exótica y porque es rico en nutrientes, además, presenta beneficios para la salud debido a sus propiedades nutracéuticas. Esto ha fomentado que en Costa Rica se desarrollen diferentes líneas de investigación con el objetivo de conocer los aspectos agronómicos y productivos alrededor de este cultivo (Dembitsky et al. 2011, Tenore et al. 2012).

Las enfermedades que afectan a esta plan- ta, han sido estudiadas desde hace seis años para determinar los agentes causales asociados. Una de las patologías de carácter abiótico que se pre- sentan en este cultivo y de la cual se tiene poco conocimiento es la mancha blanca que recubre la epidermis de los tallos. Es posible que asociada a esta, se encuentran cristales de oxalatos de calcio (Ca2C2O4 o CaOx) (Retana 2015), que es común en las cactáceas.

Se han encontrado estos cristales en célu- las de la epidermis de 245 especies de cactus (Hartl et al. 2007). Asimismo, Viñas (2011) menciona la presencia de Ca2C2O4 dentro de células de los tallos de 2 genotipos de pitaha- ya (Orejona y San Ignacio), que se cultivan en Costa Rica. También se ha encontrado sílice cristalino (SiO2) en algunas especies de cactus (Monje y Baran 2000).

Generalmente dichos cristales se forman dentro de la membrana intravacuolar o cámara cristal de células especializadas llamadas idio- blastos. En algunos casos se forman fuera, pero muy cerca de esta organela. Existen proteínas, como la calsequestrina, que regulan la actividad del calcio citosólico antes de ser almacenado en las vacuolas (Franceschi y Horner 1980, Webb 1999, Franceschi et al. 1993, Faheed et al. 2012).

El precursor primario para la formación de los oxalatos es el ácido ascórbico, a partir del cual se forma ácido oxálico. Cuando las concen- traciones de esta sustancia son altas, se activa la enzima oxalato oxidasa, proteína que actúa como regulador de ácido oxálico y participa en la for- mación de los cristales de oxalato (Keates et al. 2000, Kostman et al. 2001, Volk et al. 2002).

Se especula que en cactus “primitivos” los oxalatos de calcio se forman a partir del metabo- lismo CAM y se depositan como cristales mono- hidratados (whewellita), que es la forma más estable, con el objetivo de remover los excesos de iones Ca+2 de tejidos susceptibles. Algunos cactus que se han especializado conservan los oxalatos de calcio en el estado menos estable (dihidrata- dos, wedellita) para extraer Ca+2, en caso de ser necesario (Volk et al. 2002, Monje y Baran 2002, Hartl et al. 2007, Monje y Baran 2010).

A pesar de que el calcio es necesario para la regulación de procesos dentro de la célula y es un componente esencial de las paredes de esta, no se han dilucidado por completo los propósitos de almacenar calcio en forma de oxalatos y la fun- ción que cumplen estos (Hartl et al. 2007).

A la fecha no se registran reportes de deposiciones de calcio externas sobre la epidermis de los cactus, por esta razón, el objetivo del presente trabajo fue verificar la presencia de oxalatos de calcio en el recubrimiento que afecta los cladodios de Hylo- cereus costaricensis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección de muestras

La investigación se realizó en la finca “El Brillante”, la cual se dedica a la producción de pitahaya orgánica y se ubica en Miramar de Pun- tarenas (10°6’14” latitud norte y 84°48’49”longi- tud oeste), Costa Rica. La población en el área de estudio fue de 2666 plantas.ha-1, de las cuales se seleccionó 992 plantas distribuidas en 38 hileras para realizar este trabajo.

En cada una de las hileras, se observaron los diferentes síntomas presentes en los cladodios y se tomaron 50 muestras con tallos completos; cada una se envolvió en papel periódico humedecido y luego fueron colocadas en una bolsa plástica junto con la identificación correspondiente. El material que se recolectó se llevó al Laboratorio de Fitopa- tología del Centro de Investigación en Protección de Cultivos (CIPROC) de la Universidad de Costa Rica (UCR), para el respectivo análisis

Seguimiento de síntomas

Debido a la diversidad de síntomas obser- vados en la plantación se procedió a realizar un control de su evolución en el campo, a través del tiempo. Con ese propósito se marcaron 50 plan- tas con diferentes síntomas en la plantación y se procedió al control visual mediante fotografías generadas cada 15 días durante un periodo de un año con el objetivo de observar los cambios morfológicos, de tamaño y de coloración en el material sujeto a estudio

Caracterización de síntomas

Se realizó la descripción de los síntomas en las 50 muestras recolectadas, con base en las

características observadas en cada una de las par- tes valoradas que fueron textura, color, ubicación del síntoma en el tallo y facilidad de desprendi- miento por raspado. Esto se hizo con ayuda de un estereoscopio.

Aislamientos y cámara húmeda

Se realizó el aislamiento de los síntomas presentes en 20 muestras mediante la metodo- logía descrita por French y Hebert (1980) para hongos y bacterias. La desinfección del material se llevó a cabo con etanol al 70% e hipoclori- to de sodio al 1% durante 50 y 20 segundos, respectivamente.

Los medios de cultivo utilizados fueron agar-papa-dextrosa al 1,5% (PDA) y V8 (Atlas 2010). Se rasgó el tejido de manera longitudinal y se extrajeron segmentos de la zona de avance en la parte interna del mismo tanto en la parte afec- tada como en la parte sana donde se presentaron síntomas. Se realizaron 2 repeticiones por cada medio utilizado para un total de 80 aislamientos que fueron incubados en una cámara a tempera- tura de 25-30°C y en oscuridad por un periodo de 7 días.

Paralelamente, se colocaron 5 segmentos de tejido sintomático en una cámara húmeda y posteriormente se realizaron evaluaciones de los cambios registrados en el material, durante 2 semanas.

Análisis foliar

Se hizo un análisis foliar, químico comple- to de una muestra compuesta de tejido sintomáti- co, obtenido de 4 cladodios y otra de tallos sanos que se llevó a cabo mediante la digestión húmeda con HNO3 y determinación por Espectrometría de Emisión Atómica con Plasma (ICP), bajo la certificación CIA-SC09-01-01-P10. El análisis se llevó a cabo en el Laboratorio de Suelos y Folia- res de la UCR.

Análisis mediante microscopía electrónica

El análisis de tejido sintomático se efectuó con microscopía electrónica de barrido en el Centro de Investigación en Estructuras Micros- cópicas (CIEMIC) de la UCR; se recolectó 1 cm2 de 2 muestras de tejido sintomático, una con síntomas iniciales y otra con síntomas avanza- dos de la enfermedad y se fijaron en reactivo de Karnovsky al 2,5% por 24 horas. Posteriormen- te, se lavaron 3 veces por 10 min con buffer de fosfatos de sodio (0,1M, pH 7,4) y luego se pos- fijaron en tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% en un buffer de fosfatos de sodio, aproximadamente por 1 hora, y se aplicaron 3 lavados de 15 min con agua destilada.

Posteriormente, se llevó acabo la deshi- dratación de las muestras mediante un lavado con etanol en concentraciones ascendentes: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 2 lavados al 100% durante 10 min cada uno. Luego, se sometieron a 4 inmersiones de 15 min en alcohol terbutílico (Mallinckrodt) y después se secaron por medio de un sublimador.

Las muestras se colocaron en bases de aluminio de 15 mm, por medio de cinta de carbono de doble cara adhesiva, con puntos de contacto por medio de pintura de plata. Las muestras se recubrieron con aproximadamente 40 nm de metal Au/Pd con un cobertor iónico; las bases de aluminio con las muestras se obser- varon en el microscopio electrónico de barrido, el cual opera a 15KV

Determinación de la morfología de los cristales

Se determinó la morfología de los cris- tales presentes en cada una de las muestras mediante la observación de estos en el microsco- pio electrónico de barrido. Estas se compararon con las morfologías encontradas por Hartl et al. (2007) en diferentes géneros de cactáceas, entre ellas Hylocereus, las cuales son: en el caso del estado monohidratado: romboidal, prismática, de barra (estiloide y rafidio), pinacoidal, agre- gado esférico (drusas) y transiciones entre estos; y en estado dihidratado: prisma tetragonal, piramidal tetragonal, bipiramidal tetragonal y pinacoidal basal.

Análisis mediante espectrometría de rayos X

Se realizó el análisis de tejido sintomáti- co con espectrometría de rayos X en el Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas, UCR. Para esto se tomó 1 cm2 de 2 muestras de tejido sintomático, una con síntomas iniciales y otra con síntomas avanzados de la enfermedad. Las muestras se dejaron secar y luego se coloca- ron en bases de aluminio de 15 mm por medio de cinta de carbono de doble cara adhesiva. Las bases de aluminio con cada muestra se obser- varon en el microscopio electrónico de barrido, con sonda de rayos X incorporado, el cual opera a 15KV

Análisis mediante difracción de rayos X

Se realizó el análisis de tejido sintomático con difracción de rayos X en la Unidad de Difrac- ción de Rayos X de la Escuela de Química, UCR. Esto se realizó con material obtenido del raspado del recubrimiento presente en 6 cladodios con síntomas intermedios y 6 cladodios con síntomas avanzados de la enfermedad.

Se eliminó la materia orgánica presente en las muestras en hipoclorito de sodio al 6% por 24 horas. Posteriormente, se les realizó varios lava- dos con etanol al 70% y se filtró el producto final.

El material seco se analizó con difracción de rayos X. Esto se llevó a cabo con un equipo de difracción de polvos D8 Advance. Se utilizó una fuente de Cukα1-k α2, con configuración Bragg Bentano y detector lineal Lynx-eye. Se realizaron barridos en 20 de 5º a 60º con un incremento de 0,019º por paso y una velocidad por paso equiva- lente de 334 s.

Se hizo uso de la base de datos de difrac- ción de rayos-x en polvos International Centre for Diffraction Data (Kabekkodu 2007) para la comparación e identificación de los minerales presentes en las muestras.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos de las pruebas anteriores, se relacionaron con la fisiología de la planta y con aspectos de carácter patológico aso- ciados a la misma. Además, se analizó la interac- ción de estos resultados y los patógenos presentes en el sitio de estudio.

En evaluaciones preliminares de las enfer- medades asociadas al cultivo de la pitahaya se observó sobre la superficie de tallos un recu- brimiento de color blanco-grisáceo que avanzó hasta cubrir por completo los cladodios. Durante el desarrollo del estudio se determinó que estados avanzados del síntoma se presentan únicamente en tejido maduro.

Con el seguimiento de los síntomas se logró identificar que la enfermedad inicia como una sustancia amarillenta endurecida que brota de las areolas, que luego se extiende de los bor- des de los tallos y progresa hacia el centro de los cladodios (Figura 1A). Con el paso del tiempo, el recubrimiento adquiere una tonalidad blanqueci- na (Figura 1B) hasta que en estados avanzados se torna completamente blanco-grisáceo (Figura 1C y 1D) y cubre completamente el tallo (Figura 1E y 1F). Dicho revestimiento, tanto en etapas iniciales como finales, se puede desprender si se le realiza un raspado.

En los aislamientos realizados no se pre- sentó el crecimiento de microorganismos. Los resultados de la cámara húmeda fueron similares, debido a que no se obtuvieron signos de algún organismo presente en los tejidos analizados. Lo anterior, permitió asociar los síntomas con facto- res de carácter abiótico.

De acuerdo con el análisis foliar, el tejido afectado presentó 4,39% y el sano 1,78% de calcio, es decir, se obtuvo 147% más de este elemento en material sintomático en comparación con el sano (Cuadro 1). Juárez et al. (2012) reportan que los porcentajes de calcio presentes en el interior de los tallos de pitahaya se encuentran en el rango de 0,43 - 0,48% mientras que en esta investigación se eviden- ció que las plantas en estudio absorben más calcio, esto es 1,3%, posiblemente porque en el suelo hay un alto contenido de ese mineral (Cuadro 2).

La diferencia en contenido de calcio entre el tejido sintomático y el tejido sano (2,6%) indicó que este elemento es un componente abundante en el recubrimiento sobre la epidermis de este cactus. Otro elemento presente en dicho revesti- miento, fue el silicio, en análisis foliares previos se obtuvo 1790 ppm de este elemento en clado- dios sintomáticos y 1045 ppm en tallos sanos.

Se encontraron diferencias en los porcenta- jes de otros elementos analizados en tejido sano y enfermo. En este último se obtuvo un 60% y 39% menos de nitrógeno y potasio en comparación con los tallos sanos analizados (Cuadro 1). Proba- blemente, esto se debió a que, durante el periodo en que se realizó el estudio 2011-2013, se lleva- ron a cabo en la plantación algunas aplicaciones foliares de fertilizante con alta concentración de elementos que posiblemente recubrieron los cladodios enfermos y no permitió la absorción foliar; además vale señalar que los elementos mencionados son móviles dentro de la planta, por lo que se encuentran en mayor concentración en tallos jóvenes. Las muestras para el análisis de material sintomático se tomaron de cladodios maduros, debido a que la mancha blanca, como se mencionó, se presenta principalmente en tejido viejo. Lo anterior, sugiere una explicación de las diferencias descritas.

Según lo observado en las Figuras 2 y 3 se expone la presencia de cristales en tejido enfer- mo, tanto con síntomas iniciales como en estados avanzados. De acuerdo con su forma y al espectro obtenido por espectrometría de rayos X, se deter- minó que se componen de oxalato de calcio, que es un compuesto frecuente en cactáceas, ya que se ha encontrado en 8 especies pertenecientes al género Hylocereus (Monje y Baran 2002, Hartl et al. 2007).

Viñas (2011) observó cristales de este compuesto en tejido interno de 3 genotipos de H. costaricensis (Orejona, Cebra y San Ignacio) cultivados en la misma finca donde se realizó la presente investigación.

A partir de los análisis por espectro- metría de rayos X realizados en diferentes cristales, se logró identificar un ámbito de concentración de 16% a 72% de Ca (Cua- dro 3). Estas diferencias en el contenido del elemento, se pueden deber a la cantidad de iones disponibles, a procesos que ocurren a lo interno de la planta y a factores ambientales involucrados en la formación de los cristales (Franceschi y Horner 1980, Monje y Baran 2002). Otro elemento detectado en los crista- les fue el silicio en concentraciones menores a un 4%, por lo que no se consideró como un factor causal primario asociado a la enferme- dad (Cuadro 3).

Los cristales encontrados en los tejidos analizados mostraron una morfología monohi- dratada. Estos pueden presentar forma romboi- dal (Figura 2A), prismática, de barra (estiloides (Figura 2B, 2C) y rafidios (Figura 2D)), pinacoi- dal (Figura 3A y 3B), agregados esféricos (drusas) y transiciones entre estos. No se encontraron cristales dihidratados, los cuales muestran forma piramidal tetragonal, bipiramidal tetragonal y pinacoidal basal (Hartl et al. 2007).

A pesar de lo anterior, en el género Hylo- cereus se pueden encontrar cristales con ambos estados de hidratación, los cuales se almacenan en la hipodermis, en el parénquima cortical y en la epidermis (Hartl et al. 2007). En varios geno- tipos de Hylocereus costaricensis se observó la presencia de cristales de oxalato en el interior de los tejidos con una amplia variabilidad en las morfologías y estados de hidratación de los mismos. La frecuencia de aparición de cada una de las formas fue variable entre genotipos (Viñas 2011).

Cabe destacar que la formación de los cristales no es un proceso al azar. Existen pará- metros biofisicoquímicos en el interior del cristal así como fuerzas mecánicas, que podrían afectar fuertemente el desarrollo de estos; además, facto- res como la temperatura, la presión y la concen- tración de iones, pueden modificar la morfología y las propiedades del cristal (Franceschi y Horner 1980, Monje y Baran 2002)

Respecto a lo anterior, Franceschi y Nakata (2005) indican que las diferentes formas podrían desarrollarse a partir de especies de oxalato con una química idéntica, pero el ambiente celular regula tipos específicos del cristal así como su función. De acuerdo con esto, y por la naturaleza patológica de este estudio, las morfologías de los cristales encontrados sobre la superficie del tallo de la pitahaya posiblemente variaron en compara- ción con las conformaciones reportadas por Viñas (2011), debido a que quizás este arreglo molecular permite una mejor cobertura sobre el tejido, sobre todo en tallos con síntomas avanzados.

Análisis mediante difracción de rayos X

Al comparar el patrón de difracción de rayos X obtenido de las muestras con la base de datos ICCD (Kabekkodu 2007), se confirmó la presencia de oxalatos de calcio en su forma monohidratada en ambos estados de desarrollo de la enfermedad (flechas azules). La intensidad del patrón de los Ca2C2O4 fue relativamente baja

probablemente debido a la presencia de la matriz

orgánica (picos negros en la frecuencia) que permanece a pesar del tratamiento previo a la extracción (Figuras 4 y 5).

No se detectó la forma dihidratada de estos, debido a que el equipo utilizado no detecta la wedellita. Lo anterior, no permitió determinar si en el material analizado sólo se puede encontrar conformaciones monohidratadas de los cristales, sin embargo, se presume que sobre la superficie únicamente se presenta whewellita, porque este es el estado de hidratación más estable. Además, los estados dihidratados fácilmente se convierten en estados monohidratados (Monje y Baran 2002, Volk et al. 2002).

Estos resultados respaldan las observa- ciones de los cristales de este compuesto en el microscopio electrónico y confirman que los oxa- latos están asociados al recubrimiento que causa la enfermedad abiótica mancha blanca. Como ya se mencionó, es frecuente encontrar CaOx en tejidos internos de diferentes cactus (Hartl et al. 2007), por lo que posiblemente los cristales encontrados en H. costaricensis se originen en el interior de la planta.

Los oxalatos de calcio están implicados en funciones tales como la regulación del pH de la célula, percepción de la fuerza de gravedad, soporte mecánico e incluso defensa de la planta contra la herbivoría. Asimismo, pueden estar relacionados con una característica fisiológica particular de las plantas suculentas, la preserva- ción del agua (Franceschi y Horner 1980, Molano 2001, Monje y Baran 2002).

Alteraciones fisiológicas y patológicas

Debido a que los cristales de oxalato de calcio están asociados al recubrimiento que pro- voca la enfermedad “mancha blanca”, se deter- minó que estos posiblemente tienen un efecto negativo sobre la fotosíntesis de la planta, debido a que afectan la función clorofílica al impedir la incidencia de luz en los tallos. Asimismo, se alte- ra el intercambio gaseoso, ya que altas concen- traciones de Ca+2 promueven el cierre estomático (Da Silva et al. 1985). Además, es probable que la red de cristales bloquee los estomas, lo que reduce la captación de dióxido de carbono duran- te la noche.

Con base en observaciones de campo, en tallos con síntomas muy avanzados, especí- ficamente en los cladodios principales, ocurrió la senescencia completa del tejido, debido a la entrada de patógenos que dejó al descubierto el haz vascular. Lo anterior, se dio primordialmen- te por la infección y desarrollo de la bacteria E. hormaechei, lo cual ocurrió después de que presentara el recubrimiento en la superficie del cladodio (Figura 6).

En el área de estudio se observó que todas las plantas presentaban el recubrimiento cálcico, tanto las plantas expuestas a pleno sol como las que se encontraban en sombra, sin embargo, en las primeras el desarrollo del recubrimiento cál- cico fue mayor. Horner HT. 2006. Función de los oxalatos de calcio (comunicación personal). Iowa State University, Iowa, Estados Unidos, citado por Hartl et al. (2007), menciona que posible- mente los oxalatos se acumulan dentro de células epidérmicas como un mecanismo de protección contra el exceso de radiación solar.

Con base en lo anterior, es posible que la intensa radiación que reciben estas plantas en el sitio de cultivo sea un factor que estimula la pro- ducción e inclusive la liberación de sales cálcicas en respuesta a esta condición, como medida de protección para evitar una reducción en la tasa fotosintética. Respecto a esto, Andrade et al. (2006) mencionan que en H. undatus con una incidencia diaria entre un 36% y 48% del flujo de fotones para la fotosíntesis (µmol/s), la actividad fotosintética fue mayor en un 44% en compara- ción con plantas expuestas a una mayor o menor luminosidad.

Cabe indicar que la pitahaya crece en condiciones de sombra media, por lo que la tasa de intercambio gaseoso (TIC) depende de una intensidad lumínica moderada. Por ejemplo, la TIC de plantas de H. undatus expuestas al 70% de la máxima radiación fotosintéticamente activa (RFA) alcanzó un pico máximo de 1,89 µmol CO2 m-2 s-1, mientras que tallos que recibieron 30% de RFA presentaron un pico máximo de la TIC de 3,89 µmol CO2 m-2 s-1 (Ortiz et al. 1999). Otro aspecto que podría justificar la for- mación de este recubrimiento es que las plantas en estudio quizás presentaron un mecanismo de exudación de los oxalatos, para evitar intoxicarse con altas concentraciones de calcio, ya que el suelo tiene altos niveles de este elemento (Cuadro 2). Esta premisa se basa en lo mencionado por Ruiz y Mansfield (1994), quienes señalan que la formación y el almacenamiento de los cristales de Ca2C2O4 en células epidérmicas, es un meca mismo para regular que altas concentraciones de Ca+2 libre (regulación iónica), presentes en la corriente respiratoria, lleguen a sitios donde podrían ser fisiológicamente perjudiciales.

A pesar de lo anterior, en algunas plantas, por ejemplo Lema minor, se presentan limitacio- nes en el número de células de almacenamiento (idioblastos) que se pueden producir y en la capacidad máxima de estas para acumular los oxalatos, cuando el medio de crecimiento pre- senta un alto contenido de calcio. Una vez que los límites se alcanzan, nuevos aumentos de Ca+2 pueden conducir a efectos tóxicos, tales como una disminución en la tasa de crecimiento y senescencia (Mazen et al. 2003). En plantas de H. costaricensis, es probable que cuando se alcan- zan los límites de almacenamiento de oxalatos, ocurra la liberación de los excedentes a través de las areolas.

Un mecanismo de detoxificación, similar al que posiblemente se presenta en la pitahaya, que fue reportado en árboles de abeto rojo (Picea rubens Sarg.), cuando en el suelo se incrementa el contenido de calcio, que se transloca en mayor cantidad hacia el follaje y se almacena en célu- las de colénquima y de la cutícula, en forma de oxalato (Smith et al. 2009), resultados de este estudio y las observaciones de campo sugieren que la pitahaya posee la capacidad de exudar esta sal, que quizás se da por la eliminación de exce- dentes de calcio en el interior de la planta, más que por un mecanismo de protección ante una alta radiación solar.

Si la deposición de los oxalatos de calcio sobre la superficie de los tallos es producto de la liberación, a través de la corriente respiratoria, de excesos de calcio presentes en el interior de la planta, es probable que frente a aumentos de temperatura y de intensidad lumínica que fueron las condiciones ambientales bajo las que estuvo la plantación durante la investigación, se desen- cadene la exudación de los cristales de oxalato, debido al incremento en la tasa respiratoria. Cabe señalar que no existen reportes previos de plantas que presenten alguno de los mecanismos de res- puesta descritos ante las condiciones ambientales mencionadas

En las diferentes zonas productoras de pitahaya alrededor del mundo se reportan una serie de enfermedades bióticas tales como fusariosis (Fusarium oxysporum), antracno- sis (Colletotrichum gloeosporioides), chancros (Neoscytalidium dimidiatum), bacteriosis (Erwi- nia carotovora y Enterobacter cloacae) y virosis (Virus X) (Liou et al. 2000, OIRSA 2000, Pal- mateer et al. 2007, Wright et al. 2007, Masyahit et al. 2009, Masratul et al. 2013, Sanahuja et al. 2016 ) pero hasta el momento no se han descrito patologías de origen abiótico. Esta investigación establece las bases de la posible causa de la pri- mera enfermedad abiótica que afecta este cultivo.

AGRADECIMIENTOS

Un especial agradecimiento a la Lic. Mari- sol Jiménez Chavarría y al Dr. Adrián Pinto Tomás del Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas de la Universidad de Costa Rica, por facilitar las instalaciones y el apoyo económi- co y docente para desarrollar esta investigación.

LITERATURA CITADA

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